林氏扇头蜱抗菌肽重组蛋白对大肠埃希菌生长曲线影响及抑菌效果（四）
2.4.3不同浓度重组蛋白对大肠埃希菌生长曲线、时间-杀菌曲线的影响
从生长曲线中可看出，空白对照组在培养2 h后进入快速对数生长期，并于9 h时达到稳定期。相比之下，1/8×MIC处理组虽能抑制大肠埃希菌的生长，但抑制作用较弱；1/4×MIC处理组显著抑制了大肠埃希菌的生长，菌体数量直至10 h后才开始增加；而1/2×MIC、1×MIC处理组则完全抑制了大肠埃希菌的生长。除6 h时对照组与1/8×MIC处理组的OD600 nm差异无统计学意义，其余时间各处理组的OD 600 nm均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），重组蛋白能延缓大肠埃希菌的生长速度，且其抑菌活性呈现浓度依赖性。见图3A。
图3不同浓度Microplusin-like对大肠埃希菌生长曲线（A）和时间-杀菌曲线（B）的影响
时间-杀菌曲线显示，与对照组相比，经重组蛋白处理的大肠埃希菌活菌数在5 min内均下降（P<0.05）；1×MIC处理组曲线在15 min内略有下降，随后趋于平稳并略有上升，说明该浓度蛋白对大肠埃希菌有一定的抑制作用，但未能有效杀灭细菌；4×MIC处理组曲线显著下降，在60 min左右达到最低点，随后略有上升，说明该浓度药物具有较强的杀菌活性，使菌落形成单位数大幅降低，重组蛋白浓度与杀菌效果呈正相关。见图3B。
2.5重组蛋白抑菌机制探究
2.5.1电子显微镜分析
与对照组相比，经重组蛋白处理后的细菌细胞质膜和细胞壁出现破损，内容物外泄，导致细胞内部松散（图4A~图4B），菌体明显皱缩，边缘模糊，菌体间相互粘连（图4C~图4D）。
图4经Microplusin-like处理后大肠埃希菌透射电镜（TEM）及扫描电镜图（SEM）注：红色箭头为菌体受损部位；A、B、D.×20 000；C.×22 000。
2.5.2分子对接
Microplusin-like三维模型由6段α-螺旋结构盘旋而成的相对紧凑的稳定折叠形态，具有3个二硫键（图5A~图5B）。在Microplusin型蛋白中，二硫键有助于整体折叠的稳定性，特别是保持α-螺旋的位置。对结构进行PROCHECK评估，97.6%的残基落在最理想的区域（图5C），这些区域代表了稳定的二级结构，高比例的核心区域表明蛋白质结构大致符合理想构象，可用于后续分析。
图5 Microplusin-like的三维结构模型及PROCHECK评估结果注：A.Microplusin-like三维结构模型；B.Microplusin-like的Carton结合Sticks结构；C.PROCHECK评分图。
Microplusin-like重组蛋白与脂多糖转运蛋白（4RHB）分子对接的最佳构象所示，2个蛋白主要通过氢键进行接触，二者之间的多个氨基酸如：4RHB的Arg657、Lys346、His785、Arg623、Glu573、Arg565、Ser318、Arg326与重组蛋白的Glu67、His89、Asp87、Ser66、Thr33、Gln58、Ala62、Ala78、Thr14形成氢键；His785和Asp55形成盐桥。在分子对接结果2D可视化图中能看到相同的作用。此外，重组蛋白还与Arg542、Thr258、Glu275、Ser446、Asn782、Thr783、Asn328、Tyr613、Leu784、Lys490、Gln781、Arg511、Gln366、Val572、Asn576、Leu533、Gln323、Arg277、Leu279、Asn369产生疏水相互作用。见图6~图7。
图6 Microplusin-like与脂多糖转运蛋白的分子对接结果注：A.Microplusin-like与4RHB对接构象Surface模型，紫色代表Microplusin-like，蓝色代表4RHB；B.Microplusin-like与4RHB对接构象Carton模型；C.Microplusin-like与4RHB对接构象细节图，蛋白1的碳原子显示为蓝色，其中黄色虚线为形成的氢键，绿色虚线为形成的盐桥。
图7分子对接结果2D可视化注：绿色虚线为形成的氢键，红色虚线为盐桥作用；黑色为C原子，红色为O原子；蓝色为N原子；扇形标记氨基酸为涉及疏水接触的非配体残基。
3讨论
蜱是一类以吸血为生的节肢动物，不仅生活在适合微生物繁殖的潮湿、复杂的环境中，在吸血过程中也随时面临病原微生物的入侵。节肢动物缺通常乏获得性免疫系统，主要依赖先天性免疫系统来抵御病原体入侵，抗菌肽是昆虫先天免疫系统中的一类重要的免疫效应因子，不仅能直接清除入侵的细菌、真菌等病原微生物，还具有介导免疫细胞趋化、调控细胞凋亡、促进免疫应答和伤口愈合等生物学功能，在蜱生物防治及开发新型抗菌药物中具有发展潜力。
本试验通过生物信息学方法分析林氏扇头蜱抗菌肽Microplusin-like基因，CAMPR3在线网站涵盖了原核生物和真核生物抗菌肽序列、结构及家族特异性特征，通过该数据库检索和对抗菌肽家族特征检索，能够预测蛋白序列是否具有抑菌性；CAMPR3利用多种算法，如支持向量机、随机森林等来预测，给出一个0~1的概率分数，分数>0.5的序列具有潜在抑菌活性，分数越高，表示蛋白为抗菌肽的可能性越大；GRAVY反映的是整体亲水性（负值为亲水），GRAVY为负值的抗菌肽可能通过破坏细菌膜（疏水区）发挥作用，但其自身需要具备一定亲水性以溶于液体，为后续发挥抗菌作用奠定基础；Wimley-White专注于膜界面局部的疏水性（正值为疏水）；Boman index指数较高（2.50~3.00）意味着抗菌肽于细胞内部具备多样化的功能特性，这是由于它能够和多种不同的蛋白质产生相互作用，与之相反，数值越低（≤1），表明抗菌肽副作用越小（比如溶血活性处于较低水平），仅具备单一抗菌功能的概率较大。生物信息学预测显示该蛋白具有潜在抑菌活性，这与后续试验中重组蛋白对革兰阴性菌的抑制作用相呼应，说明预测方法具有一定的参考价值。
抑菌试验结果显示，重组蛋白对大肠埃希菌及沙门菌等革兰阴性菌具有抑制作用，表现出中度或高度敏感。不同菌株的抑菌圈直径、MIC和MBC数据表明其抑菌活性存在差异，这可能与菌株的细胞壁结构、膜通透性以及耐药机制不同有关。而对金黄色葡萄球菌等革兰阳性菌无效，这与已知的微小扇头蜱种的Microplusin对革兰阳性菌具有抑制效果的研究结果有所不同，可能是氨基酸序列差异、蛋白表达后修饰不同导致，这一推测有待进一步研究。从抑菌活性的浓度依赖性来看，随着重组蛋白浓度增加，对大肠埃希菌的抑制和杀菌效果增强，在生长曲线和时间-杀菌曲线试验中均有明显体现。但在4×MIC浓度下，细菌数量后期仍会回升，可能是蛋白浓度不够高，或者细菌产生耐药性或适应性，这与临床抗菌药物使用中面临的问题相似。透射电镜及扫描电镜结果表明，重组蛋白能够损伤菌体细胞壁及细胞膜的形态及结构，使其内部物质泄漏，还可观察到重组蛋白使胞内密度明显降低，有可能是直接干扰了细胞内过程，从而达到杀菌效果。脂多糖转运蛋白（4RHB）是大肠埃希菌细胞膜的重要结构，它们的抑制剂被认为是治疗细菌感染的有效候选化合物。分子对接用于研究多肽与指示菌关键结构蛋白之间的相互作用，分子对接结果表明重组蛋白与大肠埃希菌外膜脂多糖转运蛋白会产生相互作用也验证了重组蛋白能破坏外膜稳定性，与微小扇头蜱Microplusin蛋白通过螯合铜离子抑制菌的呼吸的抑菌机制有所不同，但也不排除多种机制共同作用，这有待进一步的研究。
本试验成功构建pCold-SUMO/Microplusin-like重组表达载体，其表达产物具有抗大肠埃希菌及沙门菌等革兰阴性菌活性，初步分析抗菌机制为破坏细胞壁及细胞膜结构，为开发新型生物活性抑菌剂的研发提供了新的可能性。
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