牦牛源短小芽孢杆菌生长曲线测定及药敏试验、体外抑菌结果解读（一）
[目的]本试验旨在研究一株牦牛源短小芽孢杆菌(命名:TS1)的分离鉴定、抗逆性、对常用抗菌药物的耐药性以及对常见致病菌的抑菌活性，初步探索其作为益生菌添加剂在畜牧养殖中应用的可行性。[方法]对健康牦牛新鲜粪便进行100℃水浴处理10 min以筛选具有抗逆性的芽胞杆菌，进行形态学、生理生化特征及16S rRNA序列分析鉴定，通过测量生长曲线、耐酸、耐胆盐试验、药敏试验及抑菌试验等方法对其生物学特性进行研究，通过全基因测序分析其可能产生抗菌物质的类型。[结果]TS1为短小芽胞杆菌且具有耐酸、耐胆盐生长特性;TS1对于12种常见的抗菌药物敏感，且对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌具有抑菌作用。测序分析显示该菌株可编码与Amylocyclicin同源性达48.90%的一种新型抗菌肽，进而发挥其抗菌活性。[结论]短小芽胞杆菌TS1有一定的抗逆性和潜在的益生能力及广谱抗菌效果，并且在畜禽肠道微生物系统中对抗生素耐药性传递的风险较低，适合作为益生菌添加剂类抗生素替代产品。
引言
抗菌药物是人类和畜禽防治细菌感染的重要手段。随着抗菌药物的不当使用或滥用，细菌对常用抗菌药物的耐药性日趋严重。因此，“饲料端禁抗、养殖端减抗、限抗”已成为全球共识。欧盟自2006年1月开始不允许抗菌药物作为饲料添加剂使用，中国自2020年开始也禁止在畜禽养殖过程中作为饲料添加剂使用抗生素。在“禁抗限抗”的大背景下，急需开发抗生素替代产品用于畜禽临床生产实践。目前益生菌是应用较广的替代产品之一，益生菌添加剂不仅可以提高动物生长速度，还可以维持肠道菌群平衡，并且可以通过调控畜禽肠道菌群维持肠道上皮的稳态，从而促进畜禽肠道健康。益生菌本身及其代谢产物又具有广谱抗菌作用，因此筛选不同动物来源的益生菌是“减抗限抗”大背景下抗生素替代品开发的有效方式。
农业部2013年公布了饲料添加剂的品种目录，共有13种类别，其中包括短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)。短小芽胞杆菌被广泛应用的优势:1)易保存、抗逆性好，分离、培养和保藏的条件简单，对工业化工生产技术要求低，能够在肠胃中保持稳定作用并且保持较高活性;其芽胞对外在的恶劣环境(如热、紫外线、电离辐射和低pH等)有较强抵抗作用;2)当摄入足够量时能够预防或改善腹泻，缓解不耐乳糖症状，预防生殖系统感染，增强畜禽免疫力，促进肠道消化系统健康，降低血清胆固醇，帮助吸收营养成分与促进畜禽生长等。综上，短小芽胞杆菌具有易保存、活性成分高等优势，值得大量推广和应用。
本试验从健康牦牛粪便中分离到1株具有益生潜力的短小芽胞杆菌，对其形态学、生理生化、耐酸、耐胆盐、对常用抗菌药物的敏感性及对常见病原菌的抑菌活性等进行研究，旨在评价其用于制备益生菌添加剂的可行性，为动物来源的益生芽胞杆菌的开发利用提供理论基础。
1材料与方法
1.1样品来源
于甘肃将军山丹军马场无菌采集健康牦牛粪便，一部分用于室温分离短小芽胞杆菌，剩余样品-80℃保存。
1.2主要试剂
试验所需主要试剂为LB培养基(青岛海博生物技术有限公司)、LB液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)、Landy培养基(上海瑞楚生物科技有限公司)、磷酸盐缓冲液(PBS，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、革兰氏染色液(南京建成生物工程研究所)、盐酸(优级纯，HCl含量36%～38%)、牛胆盐(上海源叶生物科技有限公司，胆酸含量大于等于60%)、细菌16S rRNA通用引物及PCR 2x Taq Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、生化鉴定管(广州环凯微生物科技有限公司)、药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司和北京索莱宝科技有限公司)等。
1.3菌株的分离与纯化
取1 g左右牛粪样品至装有5 mL无菌生理盐水的玻璃试管中，用封口膜封住管口于沸水中煮沸10 min;取煮沸后的100μL上清液至装有5 mL LB液体培养基的EP管中，放入摇床，37℃、160～180 r·min-1振荡培养16～18 h;取100μL菌液加入5 mL液体培养基中再次振荡培养16 h;蘸取菌液在LB固体培养基中划线，于37℃恒温箱中倒置培养12～18 h，挑取单菌落接种LB固体培养基于37℃恒温箱培养12～18 h，再次挑取单菌落至5 mL LB液体培养基中振荡培养16～18 h，得到纯化菌液。
相关新闻推荐
2、BspE 基因缺失对牛种布鲁氏菌体外生长、胞内生存、黏附能力的影响（三）
3、平板实验测定贝莱斯芽胞杆菌WB菌株对西瓜植株的促生效应——摘要、材料与方法