摘要：旨在构建单增李斯特菌（LM）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的绿色荧光蛋白（GFP）报告系统，筛选GSH-Px的调控因子，并验证调控因子对LM生长能力和抗氧化应激能力的影响。通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）方法，构建携带gsh-px启动子区域的gfp报告质粒pFL516；通过测定携带报告质粒的亲本株10403S-pFL516荧光蛋白表达情况来验证报告质粒pFL516是否构建成功；通过测定报告质粒pFL516在亲本株10403S和各双元调控系统缺失株里的转录水平来筛选GSH-Px的调控因子；生长曲线检测该调控因子缺失对LM生长能力的影响；通过氧化应激存活试验，测定该调控因子缺失对LM抗氧化应激能力的影响。结果：PCR检测显示报告质粒pFL516成功构建并电转入14对双元调控系统缺失株，其中7对双元调控系统的缺失导致gsh-px基因转录水平上调，6对双元调控系统的缺失则导致gsh-px基因转录水平下调，1对双元调控系统缺失后gsh-px的转录水平无显著差异。选取双元调控系统lmo1508/lmo1509进一步研究发现，在非胁迫和金属离子胁迫条件下双元调控系统lmo1508/lmo1509缺失株的gsh-px转录水平显著高于亲本株10403S，说明lmo1508/lmo1509负调控gsh-px的转录水平；生长曲线结果表明lmo1508/lmo1509基因缺失不影响10403S菌株的生长能力，应激存活试验结果表明，lmo1508/lmo1509缺失显著降低LM在氧化应激条件下的存活率，表明lmo1508/lmo1509对LM的抗氧化应激能力存在正调控。结果表明，在LM中成功构建gsh-px的报告系统，并筛选出调控gsh-px的调控因子lmo1508/lmo1509，为深入了解双元调控系统与LM抗氧化酶GSH-Px之间的调控关系提供了重要的研究工具。

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM）是一种革兰阳性、兼性厌氧的食源性致病菌，通常经污染的食品进入人类和动物体内，可穿透肠道屏障进入血液，然后通过血液循环突破血脑屏障和胎盘屏障，进而引发严重的李斯特菌病。该病对老人、婴幼儿及孕妇等免疫力低下的人群危害极大，主要症状表现为败血症、脑膜炎、流产甚至死亡。

LM在自然界中无处不在，可以在多种不利环境，如强酸、强碱、高渗透压、低温和氧化应激环境中生存，这一特性对食品环境安全构成了严重的威胁。氧化应激是最常见的一种不利环境，LM所面临的氧化应激包括活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、活性氯（RCS），体内活性物质过多使氧化和抗氧化系统失衡造成氧化损伤，氧化损伤会对细菌产生不良影响，如脂质过氧化、蛋白质变性、DNA损伤，甚至可能导致细胞死亡。LM在宿主胞内存活的关键在于平衡胞内的活性物质并将损伤的DNA和蛋白质进行修复和清除。因此LM需要强大的抗氧化系统对抗因活性物质过量造成的危害。LM的抗氧化系统主要分为两类：非酶促和酶促，其中非酶促抗氧化系统包含多类非酶类抗氧化物质，如抗坏血酸、谷胱甘肽、生育酚、维生素E、类胡萝卜素和脯氨酸等，酶促则是LM可利用各类清除酶抵抗氧化应激。LM中经典的酶促抗氧化防御系统由硫氧还蛋白、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶及谷胱甘肽硫转移酶等组成，它们协同作用帮助LM抵抗氧化应激。

双组分信号转导系统（TCS），又称双元调控系统，广泛存在于细菌中，参与调控细菌的一系列生物学过程，如细胞分裂、环境代谢的适应性、群体感应、生物被膜的形成和毒力基因的表达等。典型的细菌TCS由组氨酸传感激酶（HK）和应答调节蛋白（RR）组成。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）在真核生物中是抗氧化系统中一种重要的抗氧化酶，但在原核生物中的研究很少。GSH-Px在细胞降解过氧化氢和有机氢过氧化物的过程发挥显著作用。因为绿色荧光蛋白（GFP）具有荧光稳定且在各物种中均能稳定表达的优点，所以为了深入研究GSH-Px在LM中的作用，本文成功构建GSH-Px绿色荧光报告系统并通过该报告系统筛选调控GSH-Px的调控因子，为GSH-Px在LM中的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与载体

LM参考菌株10403S（血清型为1/2a型）、大肠杆菌DH5α、携带gfp片段的质粒pFL251、载体质粒pERL3均由本实验室保存；LM的14个TCS缺失株由本实验室前期构建并保存，其缺失的TCS具体信息及主要功能见表1。

表1 LM的14个TCS缺失株所缺基因信息

1.2 主要试剂

2×Taq Plus Master Mix Ⅱ购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；核酸染料Goldview购于上海自赛百盛公司；琼脂糖、DNA Marker购自擎科生物有限公司；限制性内切酶SalⅠ购自NEB公司；重组连接酶购于艾德莱生物有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、红霉素（EM）均购自Sigma-Aldrich公司；脑心浸液培养基（BHI）购自北京拜尔迪生物技术有限公司；LB培养基购自北京陆桥生物科技有限公司。

1.3 引物设计

LM中lmo0983编码gsh-px，而通过生物信息学网站www.biocyc.org查询得知lmo0982和lmo0983共用1个启动子。以LM参考菌株10403S基因组为模板，选取lmo0982和lmo0983基因前600 bp序列通过启动子预测网站（Promoter Prediction by Neural Network）预测出gsh-px的启动子区域，并参照gfp基因序列通过Vector NTI软件设计扩增引物（表2），引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。

表2 引物序列信息

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