家兔肺支气管败血波氏杆菌生长曲线测定及耐药性研究（二）
1.2.2 分离株生长曲线的绘制
挑取分离株单个菌落,接种于 5% 血清 TSB 固体培养基上,连续接种两次。挑取 TSB 培养基上的单菌落接种到 10 mL 的 LB 液体培养基中,180 r/min,37 ℃过夜培养后按 1% 比例接种到 3 个 100 mL 的 LB 液体培养基中,于 37 ℃、220 r/min 恒温摇床中振荡培养,持续检测 16 h,每个时间点重复检测 3 次,取平均数。以培养时间为 X 轴、OD600 值为纵轴,绘制分离株的生长曲线。
1.2.3 分离株对小鼠半数致死量(LD50)测定
将 SPF 级 KM 小鼠随机分成 6 组,6 只/组,雌雄各半,1~5 组为试验组,6 组为对照组。试验组小鼠腹腔注射 PBS 重悬菌液 0.3 mL,对照组注射等量的无菌 PBS。注射菌量分别为 1.02×109、3.6×108、3.6×107、3.6×106、3.6×105 CFU。然后将小鼠放回原笼中按之前饲养方式继续饲养,观察小鼠的生长情况并记录结果。应用 SPSS 软件对各组注射菌量、动物数、死亡数进行数据分析,并计算半数致死量(LD50)。
1.2.4 分离株药敏试验
采用 K-B 纸片扩散法进行分离株的药敏试验。取 180 r/min、37 ℃过夜培养的菌液 1 mL,调整菌液浓度至 0.5 麦氏浊度,每个 MH 培养基均匀涂布 100 µL 菌液后贴上药敏纸片,37 ℃培养 20 h 后测定抑菌圈直径,判定结果。
1.2.5 超广谱 β-内酰酶耐药基因检测
用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取分离株的 DNA,根据 NCBI 上公布的序列设计 bla-OXA、bla-TEM、bla-SHV、bla-CTX 的 PCR 引物(见表 1),检测该菌株的耐药基因。反应体系(20 µL):2× Taq PCR Master 10 µL,上下游引物各 1 µL,DNA 模板 1 µL,ddH2O 补足反应体系 20 µL。反应程序:95 ℃预变性 3 min;95 ℃变性 30 s,57 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 8 s,共进行 35 个循环;72 ℃额外延伸 5 min。PCR 扩增的条带用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测。
表 1 引物及序列
基因名称:16S rDNA
引物序列(5'→3'):F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT
片段长度(bp):1540
退火温度(℃):53
基因名称:bla-OXA
引物序列(5'→3'):F:GTGAAGCGTGTTGGTTAT; R:AGCCTACTTGTGGGTCTA
片段长度(bp):274
退火温度(℃):53
基因名称:bla-TEM
引物序列(5'→3'):F:TGAATGAAGCCATACCAA; R:AGATAACTACGATACGGGAG
片段长度(bp):279
退火温度(℃):53
基因名称:bla-SHV
引物序列(5'→3'):F:GACCGCTGGGAAACGGAACT; R:CCCGCAGATAAATCACCACAAT
片段长度(bp):307
退火温度(℃):57
基因名称:bla-CTX
引物序列(5'→3'):F:GTTGTTATTTCGTATCTTCCAG; R:ATTCGGTTCGCTTTCACT
片段长度(bp):311
退火温度(℃):53
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