牛源解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶活力测定、抗逆性及药敏试验（一）
摘要
本试验旨在筛选具有良好耐受性、抑菌活性及高产纤维素酶的菌株，为后续饲用微生态制剂的开发研究提供优质菌株。首先将处理好的牛粪样原液通过羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基进行选择性培养，经刚果红染色初筛及DNS法复筛后，筛选出具有良好耐受性和抑菌活性且高产纤维素酶的菌株;随后对目标菌株进行形态学、生理生化、16S rDNA鉴定和单因素发酵条件优化，同时进行药敏、抗逆性、体外抑菌、溶血性试验，验证其益生特性及安全性。结果显示:本试验成功筛选出了1株高产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，所产纤维素酶活力最高可达126.37 U/mL，对人工胃液、人工肠液具有良好的耐受性，且对大肠杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌均具有抑菌作用，对大部分常用抗生素敏感且不具有溶血性，无可移动耐药基因及毒力基因，无致病性基因。综上所述，本试验从牛粪便中分离出的解淀粉芽孢杆菌具有良好的益生潜力和安全性，可作为饲用益生菌候选菌株。
饲料成本约占畜禽生产总成本的70%，因此提高动物对饲料的利用率是降低生产成本、提高养殖效益的最佳途径。饲料效率指用于满足畜禽生产和维持需要的饲料的占比，它是畜牧业生产中一项重要的经济性状。Hamann等的研究表明，温度上升、二氧化碳浓度增加、干旱和营养状况差异等情况，直接或间接影响了草食动物对食物的消耗。纤维素是一种大分子多糖，不溶于水和一般有机溶剂，是植物中主要的多糖化合物，主要用于形成植物细胞壁，因此植物性饲料中存在大量纤维素。但由于哺乳动物自身不能产生分解纤维素的纤维素酶，因此在饲粮中添加能产纤维素酶的微生物制剂是一种有效地提高饲料利用率的途径。纤维素分解菌群是草食动物重要的肠道菌群之一，能够促进纤维性饲料的有效分解、消化和吸收，从而提高动物的生产能力。
目前，微生物饲料添加剂涉及的菌株有乳酸杆菌、芽孢杆菌、真菌等。其中，芽孢杆菌能够产生降解饲料中各类多糖的丰富酶类，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等，能充分破坏植物性来源饲料的细胞壁，使细胞中的各类营养物质释放出来。芽孢杆菌还可产生多种抗菌物质，具有促进动物体生长、抑制病原的优点。近年来有关牛源益生芽孢杆菌的研究有一定的报道，如奶牛瘤胃液和肠道内容物中产酸和抗氧化芽孢杆菌的分离鉴定和益生性质分析，菌株来源主要集中在我国北部地区，且只通过16S rDNA分子检测进行鉴定，并不能全面地分析菌株的功能特性。本试验通过全基因组序列分析和功能预测并结合益生特性试验，从广西北部湾地区健康肉牛粪便中筛选高产纤维素酶、具有抑菌活性的潜在益生菌株，为后续进一步开发反刍动物饲用微生态制剂提供优秀候选菌株。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1样品
牛粪样品采集自广西南宁某大型肉牛养殖基地。
1.1.2培养基
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基:蛋白胨2.5 g，酵母粉2.5 g，CMC-Na 2.5 g，磷酸二氢钾0.25 g，氯化钠1.25 g，琼脂5.0 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH至7.2，121℃灭菌20 min。
种子培养基:蛋白胨0.5 g，牛肉膏1.0 g，酵母粉0.5 g，葡萄糖0.5 g，氯化钠0.5 g，蒸馏水100 mL，121℃灭菌20 min。
发酵产酶培养基:蛋白胨0.75 g，酵母浸粉0.125 g，硫酸铵0.5 g，磷酸二氢钾1.0 g，氯化钠0.075 g，硫酸镁0.075 g，CMC-Na 5.0 g，蒸馏水250 mL，121℃灭菌20 min。
哥伦比亚血琼脂培养基和LB培养基购自青岛海博生物技术有限公司，NB培养基购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2试验方法
1.2.1牛粪样品处理
取新鲜牛粪样1.0 g，置于9 mL无菌生理盐水中，37℃、摇床200 r/min振荡培养0.5 h使其充分混匀后，置于75℃水浴锅中水浴15 min，以杀死非芽孢菌体，然后86×g离心10 min，使粪样中杂质沉淀。
1.2.2产酶菌初筛
将处理好的牛粪样原液用无菌水梯度稀释至10-1~10-6，无菌吸取10-4、10-5、10-6上清液200μL，均匀涂布至CMC-Na培养基上，37℃培养2 d;在平板上加入刚果红染液(1 mg/mL)，静置0.25 h后弃染液，加入4%的氯化钠溶液，冲洗脱色后，向平板中加入4%氯化钠溶液静置脱色0.5 h。若菌落周围出现透明圈即为阳性，测定透明圈直径和菌落直径，计算酶活指数(EI，透明圈直径/菌落直径)，并将其接至LB固体培养基划线培养纯化3次，得到纯化菌株。
1.2.3细菌鉴定
1.2.3.1形态学鉴定
将纯化后的待测菌株接种至LB固体培养基上进行划线，使其长出单个菌落，观察菌株形态及大小，并对其进行革兰氏染色后镜检。待测菌株扫描电镜图片委托湖北塞维尔生物科技有限公司拍摄。
1.2.3.2生理生化鉴定
参考《伯杰氏细菌鉴定手册》对纯化后的待测菌株进行生理生化鉴定。
1.2.3.3 16S rDNA鉴定
将纯化后的待测菌株接种至LB固体培养基中，用chelex-100法提取DNA。以提取的菌株DNA为模板，用细菌通用引物27F/1492R扩增16S rDNA基因序列。PCR体系(20μL):2×Taq MasterMix 10μL，上、下游引物各0.4μL，DNA模板1μL，Sterile Water 8.2μL。扩增程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共进行30个循环。将PCR产物委托武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，所得序列通过EzBioCloud比对进行同源性分析。
1.2.4目标菌株产纤维素酶活力测定
1.2.4.1粗酶液制备
将目标菌株接种至50 mL种子培养基中，培养18 h后将其接种至发酵产酶培养基中，37℃、摇床180 r/min振荡培养2 d，取5 mL发酵液1 760×g离心10 min，所得上清液为粗酶液。
1.2.4.2葡萄糖标准曲线绘制
分别吸取1 mg/mL葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL置于比色管中，用蒸馏水补充至1.5 mL，再加2 mL DNS试剂，充分混合后在沸水中煮5 min，冷却后定容至15 mL。用酶标仪于540 nm处测定吸光度(OD)值。以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标，对应的OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
1.2.4.3滤纸酶活力测定
滤纸酶活力测定:取4支15 mL试管，在试管中加入1.5 mL醋酸-醋酸钠缓冲液和0.5 mL粗酶液;4支试管50℃预热10 min，将定量滤纸剪成50 mg的小条作为底物，卷成小卷后置于其中3支试管内，剩余1支不放滤纸作空白对照，并于该温度下反应60 min，取出样品后每个样品内立即加入2.0 mL DNS试剂，于100℃水浴5 min，取出后冷却定容至15 mL，通过酶标仪测出每个样品的OD值，将测得的OD值换算成葡萄糖浓度。
1.2.4.4纤维素酶活力计算
纤维素酶活力定义:在50℃条件下，1 mL粗酶液在1 min内水解底物生成1μg葡萄糖所需的酶量为1个纤维素酶活力单位(U/mL)。