食源性致病菌：微生物群体延滞期特点与测定方法
生长曲线群体生长延滞期的测定
目前微生物延滞期仍未基于微生物生长机理明确定义，生物学上被普遍接受的定义是：微生物群体经历环境突变，自我调整后开始繁殖的时间。几何意义上微生物延滞期是指微生物对数生长期达到最大比生长速率时，生长曲线切线的反向延长线和初始菌量水平延长线的交点在时间轴上的投影点与零时刻的时间间隔。
基于微生物生长延滞期的测定方法，微生物群体延滞期需通过生长模型拟合生长曲线间接获取。
微生物培养在延滞期有以下特点：
（1）细胞物质开始增加；
（2）有的细胞因不适应环境而死亡；
（3）微生物细胞总数有所下降；
（4）延滞期末期，细胞代谢活动能力开始增强，并开始细胞分裂。
目前测定微生物生长曲线的方法主要分为传统方法和分子生物学方法。表1中总结了应用传统方法和分子生物学方法测定微生物生长曲线进而通过模型拟合获取生长延滞期的相关研究。传统测定微生物生长曲线的方法是活菌计数法，因其不受菌悬液颜色及浊度的影响而成为测定食品中食源性致病菌的主流手段。但是该方法操作繁琐、耗时耗力，且应用该方法获取的生长参数准确性与数据点的数量及观测点的位置均相关，因此活菌计数法还需进一步改进。相较于活菌计数法，比浊法因其操作简便、省时省力的优点被广泛应用于微生物生长曲线的测定和建模研究中。然而，比浊法的检测限仅能达到106～107CFU/mL，且只可用于液体培养基的测定，同时因测定的菌悬液浓度并不是活菌浓度而导致获得的生长参数有些许误差。建议今后的研究可基于技术层面对该方法进行优化，使其能更好地描述低浓度食源性致病菌的生长，为进一步研究微生物生长提供依据。
表1应用各种方法测定食源性致病菌生长曲线的相关研究
随着分子生物学技术的不断发展，变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术和PCR等分子生物学技术也被应用于微生物生长曲线的测定，相较于传统方法，这些分子生物学技术具有省时省力、高效等优点，且可同时测定两种细菌的生长，极大地改善了传统方法的不足。应用DGGE结合PCR技术测定了单增李斯特菌和副溶血性弧菌的生长情况，进而通过Baranyi模型拟合其生长曲线获取延滞期。传统PCR技术需结合DGGE技术才可定量测定微生物的生长情况，而实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技术的出现弥补了其缺陷，实现了从定性到定量的突破。将金黄色葡萄球菌的菌液接种于猪肉中进行培养，每隔一段时间提取生长后细菌的总基因组DNA，并对其进行qPCR分析，进而根据已建立的微生物浓度与qPCR的循环阈（cycle threshold，Ct）值间的标准曲线，定量描述猪肉中金黄色葡萄球菌的生长情况，最后应用模型拟合其生长曲线，间接获取生长延滞期。同样应用qPCR技术分别定量描述了猪肉中单增李斯特菌和即食南美白对虾中副溶血性弧菌的生长情况，并对其进行模型拟合，获取了延滞期。但因qPCR技术无法区分活菌和死菌，导致实验结果有一定的误差。基于此，将叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）与多重qPCR技术相结合，极好地定量描述了生鲜南美白对虾样品中副溶血性弧菌和单增李斯特菌的生长行为。虽然PMA的应用可区分活死菌，但其会对细菌产生一定的损伤。分子生物学技术的发展为预测微生物学注入了新的活力，加速了预测微生物学的发展。然而，任何方法均需辩证地看待，即每一种方法均各有优点和局限性，因此分子生物学技术并不能完全取代传统方法，仍需根据具体的实验目的选择合适的实验方法。
综上所述，虽然微生物群体延滞期和单细胞延滞期均可采用上述方法间接获得，但是微生物群体延滞期会因拟合模型不同而不同，同时微生物单细胞生长观测方法依然存在精度低、控制难、耗时长等问题。