苯乳酸对霍氏肠杆菌生长曲线、细胞凋亡、抑制活性、DNA的影响（二）
1.3.4 流式细胞仪检测 分别取28 ℃和37 ℃培养的霍氏肠杆菌菌悬液，于4 000 r/min 离心10 min，收集菌体。将菌体用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次，重复上述离心，收集菌体，再用PBS 稀释，使菌悬液OD595nm ≈0.5。将苯乳酸添加到菌悬液 中，使其终 质量浓度为0、1/2 MIC、MIC、2 MIC，以未添加苯乳酸的菌液未对照组，分别于28℃和37 ℃振荡培养（160 r/min）24 h。取一定量的培养液离心收集菌体，将菌体用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次后，使用1 mL PI 染液染色并混合均匀，在4 ℃下避光静置30 min 后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.3.5 碱性磷酸酶（AKP）的测定 取一定量在28℃培养的霍氏肠杆菌悬液，于4 000 r/min 离心10 min，收集菌体。将菌体用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次，重复上述离心，收集菌体，再用PBS 稀释，使菌悬液OD595nm ≈0.5。将苯乳酸添加到菌悬液 中，使其终 质量浓度为0、1/2 MIC、MIC、2 MIC，置于28 ℃振荡培养（160 r/min）。分别于24 h 和48 h 取一定量的培养液离心收集菌体，将菌体用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次后，用超声破碎仪破碎菌体，使用碱性磷酸酶（AKP）试剂盒测定菌体AKP 含量。
1.3.6 细胞膜完整性的测定 前处理参考1.3.5节方法，置于28 ℃振荡培养（160 r/min）24 h。取一定量的培养液离心收集菌体，将菌体用0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次后，使用250 μL 二乙酸荧光素-丙酮溶液（2 mg/mL）进行染色后静置15 min，用PBS 清洗并重悬后，在激发波长和发射波长分别为297 nm 和527 nm 时，使用荧光分光光度计测定平均荧光强度。
1.3.7 核酸泄漏的测定 前处理参考1.3.5 节方法，置于28 ℃振荡培养（160 r/min）24 h 和48 h，离心收集上清液用紫外分光光度计在260 nm 下测定OD 值。
1.3.8 蛋白质泄漏的测定 前处理参考1.3.5 节方法，置于28 ℃振荡培养（160 r/min）24 h 和48 h，离心收集上清液用紫外分光光度计在280 nm下测定OD 值。
1.3.9 核酸凝胶电泳 前处理参考1.3.5 节方法，置于28 ℃振荡培养（160 r/min）24 h。使用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，进行DNA 琼脂糖凝胶电泳（100 V、60 min），凝胶成像系统拍照并分析。
1.3.10 运动能力的测定 为测定霍氏肠杆菌的运动能力，配制群集琼脂培养基（10 g/L 蛋白胨、5 g/L 氯化钠、5 g/L 琼脂和5 g/L 果糖），并将苯乳酸溶于培养基中，使其终质量浓度为0、1/2 MIC、MIC、2 MIC，取2 μL 菌悬液接种于群集琼脂平板表面中心处，在28 ℃培养箱内静置培养24 h。测定细菌扩散圈的直径。
1.3.11 生物被膜形成量测定 取1 mL 含不同质量浓度苯乳酸（0、1/2 MIC、MIC、2 MIC）的菌悬液至1.5 mL 离心管中，混匀后在28 ℃培养箱内静置培养48 h 和72 h。弃掉液体培养基，0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次，无菌风干燥30 min，加入1 g/L 结晶紫溶液染色15 min，PBS 清洗2 次，最后，使用33%冰乙酸溶解附着在生物膜上的结晶紫，用酶标仪测定OD595nm 处的吸光度。
1.3.12 激光共聚焦显微镜观察 取1 mL 含不同质量浓度苯乳酸（0、1/2 MIC、MIC、2 MIC）的菌悬液至无菌共聚焦玻底培养皿中，混匀后在28 ℃培养箱内静置培养72 h。弃掉液体培养基，0.1 mol/L PBS（pH=7.4）清洗2 次，无菌风干燥30 min，用1 mL 2.5%的戊二醛4 ℃下固定30 min，用1 mL 0.1 mg/mL 的AO 染色液室温避光条件下染色30 min，吸出染料，PBS 冲洗后待其表面干燥，加入1 滴抗荧光淬灭封片剂。使用激光共聚焦显微镜进行观察（激发波长488 nm，阻断滤光片波长515 nm）。
1.3.13 分子对接 从Protein Data Bank（http：//www.rcsb.org/）下 载DNA 的三级结构（ID：3CLC），在对接前对DNA 和苯乳酸进行前处理，使用工具AutoGrid4，AutoDock4 和MGL tool1.5.6进行苯乳酸和DNA 相互作用的分子对接，最后使用PyMol 对结果渲染并输出。
1.3.14 统计分析 数据为重复3 次的平均值，采用SPSS 18.0 进行ANOVA 分析，P ＜0.05 为差异显著。采用Excel 和Origin 2019b 软件处理数据和绘制图表。
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