梅花鹿源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定、测序、毒素型、生化、耐药性分析（一）
摘要:产气荚膜梭菌(Clostridium.perfringens)是危害动物养殖业的重要病原，养鹿业深受其害。本研究从临床患鹿肠内容物分离到一株C.perfringens菌株，运用16SrRNA基因序列比对、毒素型PCR及生化等方法进行菌株鉴定，并开展耐药性分析;通过腹腔注射对小鼠进行攻毒，记录其发病、死亡情况和组织病理学变化，建立小鼠感染模型。结果表明，分离株鉴定为A型C.perfringens，符合产气荚膜梭菌生化特征，对阿米卡星、多黏菌素B、链霉素、卡那霉素、克林霉素、复方新诺明几种抗生素表现出耐药特征。菌液攻毒小鼠精神萎靡，被毛凌乱，扎堆不动，剖检可见肝脏、脾脏肿大，肠壁变薄，小肠内有黄色内容物。该菌株半数致死量为7.99x107CFU·mL1。组织切片可见各组织器官充血、出血，炎性细胞浸润，小肠肠绒毛部分断裂脱落，结构不完整。本研究结果将为临床鹿梭菌防治提供指导，为C.perfringens鹿用疫苗研制奠定基础。
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)又称魏氏梭菌，广泛存在于土壤、粪便和正常人畜肠道中，是一种条件致病菌，当环境条件发生变化或自身免疫降低时可致使感染鹿发病，表现为食欲减退或废绝，精神萎靡，鼻镜干燥，口流涎，反刍刍停止，腹围增大，体温升高，运动失调，后肢麻痹，昏迷倒地等，严重时死亡。
鹿产品有极高的商业价值，其中鹿茸滋补功效显著，能够改善睡眠、缓解疲劳，其价格每克在50~200元不等。除鹿茸外，鹿肉、鹿血、鹿胎、鹿皮、鹿筋和鹿鞭等也均是重要的鹿产品。近年来，鹿养殖过程中频繁出现产气荚膜梭菌感染的现象，该疾病发病急，死亡率高，造成了极大的经济损失。因此，了解鹿感染产气荚膜梭菌的主要分型和生长特性，明晰该类菌株的耐药性和致病性，对于进一步研究如何有效预防该类菌株的感染和相关疫苗的研制有重要意义。
本研究从临床死亡梅花鹿肠内容物中分离到一株C.perfringens，进行了16S RNA测序、毒素型、生化、耐药性等分析，为临床合理用药提供指导，同时建立了小鼠感染模型，为鹿源C.perfringens的疫苗研究提供基础。
1材料与方法
1.1发病情况
2023年3月份吉林省吉林市某梅花鹿养殖场发生大批鹿死亡，主要症状包括精神沉郁、腹泻、流涎、腹围增大、粪便带血。剖检可见肠黏膜出血，肠系膜淋巴结肿大，肝脏和肾脏肿大。
1.2主要试剂和仪器
胰胨胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基TSC、梭菌增菌培养基RCM、TL-2000 DNA Maker均购自博奥龙生物科技有限公司;7%羊血琼脂基础购自青岛海博生物技术有限公司;2xMagic Green Taq Super Mix购自TOLOBIO公司;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成;革兰染色试剂、微量生化反应管均购自比克曼生物科技有限公司;厌氧产气袋购自日本三菱化学株式会社;产气荚膜梭菌a毒素(CPA)酶联免疫吸附测定试剂盒检购自上海仁捷生物科技有限公司。
恒温摇床HT-2102XS购自上海赫田科学仪器有限公司;分光光度计YJ16202208007购自上海佑科仪表有限公司;高速离心机购自Thermo公司;基因扩增仪A200购自杭州朗基科学仪器有限公司;电泳仪JY300E购自北京君意东方电泳设备有限公司;立式高压蒸汽灭菌器LDZF-50L购自上海申安医疗器械厂。
1.3实验动物
昆明小鼠48只，体重均为20g左右，雄雌各半，购自斯贝福生物技术有限公司。
1.4α毒素检测
从病死送检梅花鹿肾脏和肠内容物各取黄豆大小样本，分别加入装有1mLPBS(pH=7.4)的EP管，加入4粒磁珠，匀浆器将标本匀浆充分，2000r·min-1离心20min，收集上清待检。按照微生物产气荚膜梭菌a毒素(CPA)酶联免疫吸附测定试剂盒说明书步骤检测样本中
1.5细菌分离鉴定及毒素分型
1.5.1细菌分离鉴定用灭菌枪头从病死梅花鹿肠内容物中挑取黄豆大小的样品加入含有10mL梭菌增菌培养基(RCM)的试管中，置于摇床42℃，180r·min-1培养18h。将阳性培养物划线于胰
胨胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(TSC),42℃厌氧培养12h，观察菌落形态，挑选圆形黑色菌单落接种于RCM,42℃,180r·min-1培养18h后划线于7%羊血琼脂培养基。观察菌落形态，挑选有溶血环的灰白色单菌落进行革兰染色镜检。
1.5.2 16S rRNA检测使用16S rRNA通用引物(表1)进行PCR扩增。PCR反应体系50μL:2xGreen Taq Mix25μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL,ddH2O 21μL。PCR反应条件:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸90s,共30个循环;72延伸10 min;4℃保温。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证后,送至擎科生物(北京)公司进行测序。将测序所获序列于NCBI中进行BLAST比对分析，MEGA构建系统进化树。
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