基于体外重组鸡传染性贫血病毒生长曲线研究复制效率（二）
1.2试验方法
1.2.1 sgRNA和供体质粒的构建
参考FAdV-4 HB1505毒株的fiber-2基因序列（GenBank登录号：MZ054256.1），利用sgRNA在线设计网站（http://crispor.tefor.net/）设计靶向fiber-2基因的sgRNA，并克隆到lentiCRISPR v2载体上，通过测序进行sgRNA构建载体的验证。具体的sgRNA序列见表1，由南京擎科生物科技有限公司合成。以线性化质粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR为载体，以CIAV毒株T1P6基因组为模板扩增CIAV的VP1基因，扩增引物见表2。利用ClonExpress II One Step Cloning Kit通过同源重组构建供体质粒pMD19-HAL-CIAV-VP1-LoxP-RFP-LoxP-HAR。
1.2.2重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的构建策略
使用转染试剂Mirus将3μg sgRNA和3μg的供体质粒共转染LMH细胞。转染12 h后，以0.1 MOI的FA4-EGFP感染LMH细胞。感染病毒3~4 d后，用96孔板将上清液盲传至新的LMH细胞中，通过荧光显微镜观察红色荧光簇。红色荧光簇出现则表明成功构建重组病毒。通过有限稀释法和病毒空斑试验进一步纯化出携带RFP表达盒的重组病毒。随后，使用转染试剂Mirus将4μg pcDNA3.1-Cre转染LMH细胞。转染24 h后，以0.1 MOI将纯化后的带RFP红色荧光的重组病毒感染LMH细胞。通过荧光显微镜观察细胞，挑取无RFP表达且存在病变的LMH细胞，用有限稀释法或病毒空斑试验进行进一步纯化，最终获得去除RFP表达盒的重组病毒。
1.2.3重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的IFA检测
将感染重组病毒的LMH细胞用预冷的固定液（丙酮∶乙醇=3∶2）固定5 min，然后用PBS稀释的单克隆抗体2E3和抗FAdV-4的多克隆抗体鸡血清与固定的LMH细胞在37℃下共孵育45 min。PBS洗涤3次后，用羊抗鼠lgG-FITC和羊抗鸡lgG-FITC与LMH细胞再共孵育45 min。PBS洗涤3次后，在倒置荧光显微镜下观察有无特异性红色和绿色荧光。
1.2.4重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的Western blot检测
用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解感染重组病毒的LMH细胞。将细胞裂解物上清煮沸10 min后，离心5 min。经SDS-PAGE后，将蛋白转移到硝酸纤维素（NC膜）上。室温下，用含5%脱脂乳的PBST封闭NC膜2 h后，用单克隆抗体2E3、1B5和1C9分别孵育NC膜2 h。用PBST洗涤3次后，用HRP标记的山羊抗小鼠IgG孵育1 h。PBST洗涤3次后，用化学发光试剂显像，利用全自动化学发光图像分析系统成像。
1.2.5重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的生长曲线测定
将构建的重组病毒和野生型FAdV-4分别以0.1 MOI剂量感染LMH细胞。2 h后换成1%维持液，在感染后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h收取细胞上清液，使用单克隆抗体3B5进行免疫荧光试验（IFA）测定每个时间点的病毒效价。
1.3统计与分析
采用Reed-Muench法计算病毒的TCID50，利用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析并绘制病毒的生长曲线，采用Student t检验进行显著性方差分析。当P<0.05时，表示结果具有显著性差异。
2结果与分析
2.1带RFP的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP的拯救
构建靶向fiber-2基因的sgRNA，以CIAV毒株T1P6基因组为模板扩增CIAV的VP1基因（见图2）以及以线性化质粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR为模板通过同源重组构建供体质粒pMD19-HAL-CIAV-VP1-LoxP-RFP-LoxP-HAR。然后，按照1.2.2步骤进行重组病毒拯救。感染模板病毒3~4 d后，将上清液继续盲传，通过荧光显微镜观察到红色荧光簇（见图3A），表明成功拯救出带RFP的重组病毒，命名为rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP。随即通过有限稀释和病毒空斑试验获得纯化的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP。
2.2表达VP1蛋白的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的鉴定
通过多次转染pcDNA3.1-Cre，重组病毒感染的LMH细胞在荧光显微镜下已经观察不到其中的红色荧光簇。PCR进一步证明，通过Cre重组酶处理，成功获得了去除rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP中的RFP表达盒的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1，PCR扩增条带大小均与预期一致（见图4）。重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的IFA和Western blot检测结果见图5和图6。抗FAdV-4多克隆抗体鸡血清能与感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH细胞发生特异性反应，出现绿色荧光（见图5A）。同时，VP1特异性单克隆抗体2E3同样能特异性地与感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH细胞反应，出现红色荧光（见图5B）。合并图中绿色荧光和红色荧光几乎完全重叠（见图5C）。Western blot结果显示，VP1特异性单克隆抗体2E3能识别感染rFAdV-4-CIAV-VP1的LMH细胞中表达的VP1蛋白（见图6）。上述结果表明重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1获得了纯化，且rFAdV-4-CIAV-VP1能有效表达VP1蛋白。
2.3重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1的生长曲线测定
由图7可知，rFAdV-4-CIAV-VP1在易感细胞LMH中的复制能力远低于野生型FAdV-4，Student t检验显示存在极显著差异（P<0.001）。野生型FAdV-4病毒效价可达到10⁸·⁵TCID₅₀/mL，而rFAdV-4-CIAV-VP1的病毒效价仅为10⁶TCID₅₀/mL。
注：表示差异显著（P<0.05），表示差异极显著（P<0.01），表示差异极显著（P<0.01）。
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