副溶血弧菌活菌计数方法：MTT比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法（一）
摘要：以一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为研究对象，比较了MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法在活细菌高通量计数上的应用效果。用96孔培养板进行不同浓度细菌活菌计数，确定了上述3种方法在副溶血弧菌活菌计数的标准曲线和线性范围。结果显示，副溶血弧菌的MTT比色法以DMSO溶解的MTT产物甲瓒在555 nm的吸光度(OD555 nm)为计数依据，活菌数的对数(LgC)与LgOD555 nm线性关系的标准曲线为LgC=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125)，相关系数R2=0.9965，线性检测范围为7.8×106~2.5×108 CFU/ml；ATP生物发光法以ATP产生的相对发光度值(RLU)为计数依据，LgC与LgRUL线性关系的标准曲线为LgC=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366)，相关系数R2=0.9994，线性检测范围为1.0×104~3.0×108 CFU/ml；高通量生长曲线法以生长曲线达到拐点的时间(Ts)为计数依据，LgC与Ts线性关系的标准曲线为LgC=-(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572)，相关系数R2=0.9924，线性检测范围为1.0×100~1.0×107 CFU/ml。用3种方法对实际菌液测量并与平板计数法比较表明，ATP生物发光法与高通量生长曲线法有很好的准确性，MTT比色法准确度稍差，而高通量生长曲线法有最宽的线性范围，也最适合高通量测定。
细菌计数方法是微生物学研究的基础技术，主要分为直接计数法和间接培养计数法。直接计数法主要有显微镜观察法(包括光学显微镜技术、荧光显微镜技术等)和比浊计数法等；间接培养计数法主要有平板菌落计数法(包括传统平板计数法、微菌落技术等)和最大或然数计数法(Most probable number，MPN法，也称为稀释培养法)等(王婷婷等,2008)。传统的直接计数法不能区分细菌的死活，且灵敏度低、线性范围狭窄，间接培养计数法虽然能确定活菌数量，但工作量大，难以对大批量样品进行同时操作。例如，食品安全国家标准中的菌群计数法采用MPN法和平板计数法(GB 4789.3-2010)，这2种方法都需要培养24~48 h，且工作量大、检测线性范围窄，难以进行快速、大批量的检测工作，MPN法的精确性还存在疑问；为了简化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究，提出了电阻抗检测法、Sim PlateTM全平皿计数法、微菌落技术、最大或然数-聚合酶链式反应计数法(MPN-PCR法)、流式细胞仪测定法等检测方法，取得了一定的成果，但也存在不同的缺陷和不足。例如，流式细胞仪测定法虽然灵敏度、简便性都有了较大的提升，但由于其成本昂贵，且不能区分细菌的死活，在实际应用中受到了很大的制约。
MTT是3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，能穿过细胞膜被活细胞线粒体中的琥铂酸脱氢酶还原，形成蓝紫色不溶于水的甲瓒(Formazan)(Mosmann,1983)，死细胞酶活性丧失而没有颜色反应。用有机溶剂溶解甲瓒后(边兴艳,1998)，测定溶液的吸光度(OD值)而确定活细胞数(Gerlier et al,1986)。该法快速、经济、操作相对简便、重复性较好，近年来被广泛应用到大肠杆菌(Escherichia coli)(王栩等,2002)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(黄立坤等,2008)、伴放线菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans)(王忠朝等,2010)和酵母菌(龚加路等,2016)等的活菌计数中。
三磷酸腺苷(ATP)是所有生命活动的能量载体(Velten et al,2007)，活细菌中ATP含量会维持在一定范围，细菌死亡后ATP会在短时间内被细胞内酶所分解(Holm-Hansen et al,1966)，样品中ATP含量即可间接反映活细菌数量。ATP生物发光法(Miller et al,1992;Selan et al,1992;Nyrén,1994;McElroy et al,1949)是荧光素酶在Mg2+条件下催化荧光素与ATP反应形成荧光素-AMP的复合物，与O2结合时发光，发光强度与ATP浓度呈线性关系，从而检测活菌的数量(Moyer et al,1983;Grönroos et al,1983)。ATP生物发光法操作简便，能快速得到结果，与传统的平板计数法相比，不仅能区分细菌的死活，而且还能检测出不可培养的微生物(Hammes et al,2010)。
借鉴实时定量PCR的扩增曲线原理，利用微生物类似于PCR扩增的指数生长曲线(Brewster,2003)，建立了高通量生长曲线法，该法与传统的MPN法完全不同，是根据细菌生长达到特定浊度的时间进行活菌的计数，在微孔板的微量培养体积上，设置多个平行，以高通量的方式对微生物的生长进行实时监测，达到类似实时定量PCR那样在极宽的线性范围进行微生物的准确计数的效果。在上述背景下，本研究对MTT比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法进行了比较。
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