副溶血弧菌活菌计数方法：MTT比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法（二）
1材料与方法
1.1细菌
实验用副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的编号为20130629002S01(以下简称2S01)，取自中国水产科学研究院黄海水产研究所养殖生物疾病控制与分子病理学研究室(王娜等,2016;Dong et al,2017)。将冻存的2S01菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)平板上划线，28℃培养12 h，挑取单个菌落接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，于28℃以110 r/min过夜振荡培养，3000 r/min离心10 min，并用磷酸缓冲溶液(PBS)清洗沉淀、重悬，调整其OD600 nm=0.5，经平板计数方法检测其浓度约为1.12×108 CFU/ml。取2 ml接种于200 ml TSB培养基中，在28℃以110 r/min恒温震荡培养4~6 h，待细菌刚达到指数生长期时，用冷冻离心机4℃离心3次，并用PBS溶液清洗沉淀、重悬，调整其OD600 nm=0.5，备用。
1.2 MTT比色法
1.2.1检测波长确定
将100μl重悬菌液加入96孔细胞培养板(Corning,美国)，然后每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT溶液(溶于PBS溶液并经0.22µm滤膜过滤除菌)(Solarbio)，用微孔板振荡仪混匀，放入37℃恒温培养箱孵育2 h，取出后于4000 r/min离心10 min，吸出上清液，每孔加入150μl DMSO(Solarbio,中国)，振荡混匀10 min，设定Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪(Thermo,美国)波长在400~700 nm范围内进行波长扫描，只加DMSO作为空白对照组，每组3个平行。
1.2.2 MTT溶液的使用剂量
在相同量的菌液中分别加入终浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/ml的MTT溶液，充分反应后离心，弃上清液，每组3个平行，按MTT比色法的步骤测量各组OD值。
1.2.3干扰物质的影响
以DMSO为参比，以PBS溶液和121℃灭菌20 min的死亡菌体为样品，用MTT法测量，每组3个平行。
1.2.4 MTT溶液与菌液反应时间
分别将MTT法的37℃孵育反应经0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h后，离心弃上清液，终止反应，每组3个平行，按上述方法测量各组OD值。
1.2.5检测范围与标准曲线
将浓度为1×109 CFU/ml的菌悬液按2倍浓度梯度依次稀释为9.77×105~1×109 CFU/ml，每组3个平行，用MTT法测量各组OD值，用SigmaPlot 12.0软件进行数据分析，用Polynomial进行线性分析，建立菌液浓度与其反应后OD值的标准曲线。
1.3 ATP生物发光法
1.3.1试剂盒可靠性检测
按增强型ATP检测试剂盒(Beyotime)说明书操作步骤用试剂盒提供的ATP标准品进行试剂盒验证，并建立标准曲线。
1.3.2检测范围与标准曲线
将调整OD后的菌液稀释成浓度为3×103、1×104、3×104、1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109 CFU/ml的菌悬液，然后按照试剂盒说明书测量各组相对发光度值(RLU)，每组3个平行，建立菌液浓度与其反应后RLU的标准曲线。
1.4高通量生长曲线法
1.4.1不同浓度菌液连续培养进行OD值测定
将调整OD后的菌液稀释成1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109 CFU/ml的菌悬液，每个梯度取2µl，用8通道移液器加至预先加有198μl TSB培养基的96孔板中，每个浓度3个重复，设置PBS空白对照，用涡旋振荡仪混匀，放入28℃恒温培养箱，300 r/min振荡培养。在培养的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 h测定OD600 nm。
1.4.2建立标准曲线
将细菌培养时间和OD600 nm的读数扣除未接种细菌的培养基孔的OD600 nm值，用SigmaPlot 12.0软件进行数据分析，按Sigmoid曲线类型用3参数模式拟合，根据拟合出的方程，统计其各组菌液生长曲线达到a/2值的时间x0，建立菌液浓度与该时间的标准曲线。
1.5副溶血弧菌菌液的测量
取10份不同浓度的副溶血弧菌菌液，分别用3种计数方法与平板计数法进行对比，分析3种计数方法的计数结果(C)与平板计数法的计数结果(CP)的线性关系和变异系数(C.V.)。
C.V.=(C–CP )/CP ×100%