Mg²⁺对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长、氧化活性的影响规律——摘要、材料和方法
摘要：以嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，简称At.f菌，FN811931）为研究对象，探讨了Mg²⁺对其氧化活性的影响规律，并采用Zeta电位及红外光谱分析，考察了其影响的内在机制。结果表明：在Mg²⁺质量浓度小于5.0 g/L的体系中，培养35 h时，pH值从培养初期的2.00左右下降到1.70左右，氧化还原电位从培养初期的390 mV左右上升到600 mV以上，Fe²⁺氧化率接近100%，细菌生长达到旺盛期；当Mg²⁺质量浓度超过5.0 g/L时，体系pH值下降速率、氧化还原电位上升速率、Fe²⁺氧化率、细菌生长速率均降低，且Mg²⁺质量浓度越大，影响效果越显著。Zeta电位测试结果表明，20.0 g/L镁离子作用下细菌等电点为3.6，高于9K培养基中细菌的等电点2.7，这从宏观上解释了细菌细胞壁结构的变化；红外光谱测试结果显示，Mg²⁺作用下，细菌细胞壁中的官能团发生了交联作用，导致吸收峰N-H的消失和—OH、—C=O、—CH₃、—CH₂、—P=O、—CN的偏移，致使细胞壁表面蛋白质结构发生变化，进而影响了细菌的氧化活性。
氧化亚铁硫杆菌是通过氧化亚铁离子与单质硫或含硫化合物获取能量生长的嗜酸性化能自养菌，是常见的硫化矿浸出功能菌。黄铜矿是自然界中最主要的铜矿物，也是最难浸出的矿物之一，石榴石、橄榄石、蛇纹石及白云石等是黄铜矿中常见的共伴生脉石矿物，细菌氧化浸出时其溶出的Mg²⁺在体系中不断积累，不仅会影响铜的浸出效率，而且对浸矿微生物的生长活性也有显著影响。然而Mg²⁺又是嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，简称At.f菌）生长发育必需的元素之一，是构成某些酶的活性成分，对微生物细胞膜、核糖体等的稳定性起着重要作用，因此存在适宜Mg²⁺含量问题。若Mg²⁺含量不足，会导致核糖体与细胞膜的稳定性降低，从而影响机体的正常生长；Mg²⁺含量过高则会抑制细菌的生长。关于Mg²⁺对氧化亚铁硫杆菌的影响，李洪枚等研究了驯化菌株与正常菌株耐镁性能的影响；刘欣伟等从动力学角度描述了Mg²⁺浓度对氧化亚铁硫杆菌生长的影响，但从细菌表面电位及红外光谱分析方面揭示其对细菌氧化活性的影响研究较少。
构成At.f菌细胞壁的骨架物质是由肽链和氨基糖链组成的肽聚糖及其他多糖、蛋白质、粘多糖等成分，这些化学成分决定了细菌表面带有负电荷，细菌表面电位与带电微粒所带电荷的大小成正比，且可以通过测定细菌的Zeta电位值判断细菌表面所带电荷的量。傅里叶变换红外光谱技术可以灵敏地反映出细胞分子层面的改变，具有操作简单、重复性强、价格低廉等优点，如今已被广泛应用。应用FT-IR光谱技术可读取微生物菌体细胞壁、细胞膜及细胞内包括肽聚糖、脂多糖、磷脂双分子层、蛋白质、水、脂肪、多糖以及核酸等所有组成成分化学键的振动情况，提供整个微生物菌体生化组成成分的光谱定量信息。
因此，文中以At.f菌为研究对象，以细菌生长过程中体系的pH值、Eh（氧化还原电位）值、Fe²⁺氧化率、细菌浓度等实时参数的变化来反映培养体系中Mg²⁺浓度变化对At.f菌氧化活性影响的规律，并通过Zeta电位及红外光谱技术揭示Mg²⁺浓度对细菌氧化活性影响的内在机制，为获得浸矿细菌的最优生长和氧化活性条件提供理论依据。
1实验材料和方法
1.1菌种及培养基
试验所需浸矿菌种经鉴定为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌，同源度为99.99%，其16S rDNA gene基因库登录序列号为FN811931。菌种最佳培养条件如下：摇床温度30℃，转速160 r/min，初始pH值2.0，采用9K培养基。
微生物的富集培养采用9K培养基，其组成为：①(NH₄)₂SO₄3.00 g，KCl 0.10 g，K₂HPO₄0.50 g，MgSO₄·7H₂O 0.50 g，Ca(NO₃)₂0.01 g，蒸馏水700 mL，121℃灭菌20 min；②FeSO₄·7H₂O 44.20 g，蒸馏水300 mL，pH=2.0，经微孔滤膜（∅0.22μm）真空抽滤除菌。将①、②混合后使用。
1.2试验方法
Mg²⁺对At.f菌氧化活性的影响试验在250 mL锥形瓶中进行，在90 mL经灭菌后的9K培养基中，加入不同浓度梯度的分析纯硫酸镁，配制体系Mg质量浓度分别为0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 g/L（0 g/L代表不加入Mg²⁺时的空白试验），调节酸平衡至pH=2.0后，接入培养好的At.f菌，接种量为10%，细菌浓度为1.0×10⁸个/mL，并设置重复3组。定期测定体系中的pH值、Eh值和Fe²⁺浓度。蒸发掉的水分用蒸馏水补足，取样消耗的溶液量用相同体积的、pH=2.0的稀硫酸补充，以保证溶液总体积不变。
1.3分析方法
采用Mettler320型pH计测量培养液pH值的变化；采用BPP-922型台式ORP计检测培养液中氧化还原电位值的变化；细菌浓度采用血球计数法测定；培养液中Fe²⁺浓度采用重铬酸钾法滴定；菌种的氧化活性用细菌氧化亚铁的能力来表示。n小时后Fe²⁺氧化率的计算公式为：
采用美国布鲁克海文公司生产的Zeta Plus高分辨率Zeta电位分析仪测试细菌表面电位。取菌悬液加入到离子强度I=0.001 mol/L的KCl溶液中，细菌浓度控制在1×10⁸个/mL，稍微搅拌，使其均匀分散，然后进行细菌Zeta电位的测定，测试中采用HCl和KOH溶液调节pH值，每个样品测量3次，取其平均值。
细菌红外光谱分析采用美国Nicolet Nexus670型傅里叶变换红外光谱仪测定，采用4000~400 cm⁻¹的检测波，测定波数范围为11000~400 cm⁻¹，波数分辨率<0.1 cm⁻¹，噪声信号<5000:1（峰峰间），扫描速率>20遍/s，且至少9种。取对数生长期的菌液，过滤去除杂质，将滤液在离心机中离心20 min，转速5000 r/min，获得的细菌重新分散于蒸馏水中，同样条件下离心处理，反复多次后，经冷冻干燥后用于细菌的FT-IR检测。
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