棘孢木霉TCS007菌株的固态发酵条件、次生代谢产物产量影响因素（一）
植物病原真菌是农业生产中的主要威胁之一，不仅会导致作物减产，还可能引发严重的病害流行，给全球粮食安全带来巨大挑战。传统的化学杀菌剂虽然在防治植物病害方面发挥了重要作用，但其长期使用也导致了病原菌抗药性的增加，对环境和人类健康造成负面影响。因此，开发环境友好、高效、低残留且可持续的生物防治方法成为了当前研究的热点。
木霉属(Trichoderma)真菌是一类广泛存在于土壤中的有益微生物，具有广谱的抑菌活性，能够抑制多种植物病原真菌的生长。近年来，木霉及其代谢产物在生物防治中的应用受到了广泛关注。棘孢木霉(Trichoderma asperellum)作为木霉属中的一种，已被证明其代谢产物中含有多种具有生物活性的次生代谢物，如木霉菌素、吡喃酮类化合物等，其中的6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-pentyl-2-pyrone)对植物病原真菌具有显著的抑制作用，并且还能够诱导植物的系统抗性、促进植物生长。
不同微生物生长所需的营养环境各异，根据微生物的生长特性，需要采用特定的培养基，因此，筛选优化培养基组分与培养条件是实现微生物源药剂最大化生产的必要步骤。固态发酵(solid-state fermentation，SSF)是一种利用固体基质进行微生物发酵的技术，具有成本低、操作简便、产物浓度高等优点。与液态发酵相比，固态发酵更有利于木霉菌的生长和代谢产物的积累。固态发酵基质在为微生物提供碳、氮、无机盐等营养物质的同时，还可为微生物生长及代谢提供载体。通过优化固态发酵条件，可以显著提高木霉菌的代谢产物产量及其抑菌活性。响应曲面法(response surface methodology，RSM)可用于研究多个影响因素之间的相互作用，同时预测变量的最佳值，是微生物发酵优化中常用的准确高效的方法之一。
棘孢木霉菌株由本研究团队分离自南极海洋沉积物(菌株号：HTTA-Z0002)，经诱变稳定后鉴定并命名为棘孢木霉TCS007(T.asperellum TCS007)菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15677，菌株及其功能首次公布于中国发明专利ZL 201810935616.6和ZL 201810936028.4。前期研究已明确，TCS007菌株对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、山核桃干腐病菌(Botryosphaeria dothidea)和黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)等多种植物病原菌均有较好的抑制效果，并且发现其液体发酵滤液稀释10倍及粗提发酵产物(crude fermentation extracts，CFE)在10 mg/L质量浓度下对油菜菌核病菌的抑制率均可达到95%，由此推测其产生的代谢产物中含有活性较强的抑菌物质。此外，TCS007菌株能诱导向日葵产生系统抗性，防治由核盘菌引起的向日葵菌核病，还能诱导蚕豆、黄瓜和水稻对干旱、低温和盐碱的耐受性。可见，TCS007菌株作为生物农药和生物肥料都具有广阔的应用前景。前期研究表明，大米固态培养基发酵所得次生代谢产物产量明显高于液体培养基发酵。本研究旨在通过单因素试验和响应曲面法，进一步优化棘孢木霉TCS007菌株的固态发酵条件，以期提高其次生代谢产物产量，并探究其代谢粗提产物对油菜菌核病菌等植物病原真菌的抑制活性，为棘孢木霉TCS007菌株后续产品开发的发酵工艺确定和实际应用提供理论指导。
1材料与方法
1.1试验材料与仪器
1.1.1供试菌株
生防真菌：棘孢木霉TCS007(T.asperellum TCS007)菌株由浙江农林大学绿色农药协同创新中心分离，于−80℃冰箱中保存，备用。
植物病原真菌：油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果褐斑病菌(Marssonina coronaria)、黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、果生刺盘孢(Colletotrichum fructicola)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、草坪币斑病菌(Sclerotinia homoeocarpa)、玉米弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata)，均由本实验室分离、保存和鉴定。
1.1.2培养基
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水补至1 L，121℃灭菌15 min。
初始固态发酵培养基：300 mL三角瓶中加入大米72 g，蒸馏水48 mL，121℃灭菌15 min。
1.1.3药剂及试剂
97.5%啶酰菌胺(boscalid)原药，浙江宇龙生物科技有限公司提供。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、无水Na2SO4、HCl、NaOH、NaCl、MnSO4、MgSO4、CaCl2、FeCl3和尿素均为分析纯。
1.1.4主要仪器
BSA233S电子精密天平(精确到0.001 g，赛多利斯科学仪器有限公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；MLS-3751L-PC高压蒸汽灭菌锅(松下健康医疗器材有限公司)；MJ-150-I霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DHG-9030A台式鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；µCount3D立体计数仪(丹麦BioSense公司)；Axio Lab.A1 pol光学显微镜(欧波同有限公司)。