棘孢木霉TCS007菌株的固态发酵条件、次生代谢产物产量影响因素（四）
2.3固态发酵优化后粗提发酵产物的抑菌活性
按照上述确定的最佳优化固态发酵条件，即大米72 g、加水量47 mL、初始pH 7.0、接种量1 mL、光照周期12 h/12 h、培养温度28℃、培养时间29 d、黄豆粉添加量(质量分数)3.5%进行发酵，得到的TCS007菌株粗提发酵产物对10种植物病原真菌的抑菌活性测定结果。从中可看出，优化发酵条件后所得粗提发酵产物对供试植物病原真菌具有广谱的抑菌活性，在50μg/mL质量浓度下，其对油菜菌核病菌、苹果褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌和水稻纹枯病菌的抑制率分别为96.87%、77.42%、71.07%和62.50%，其中对苹果褐斑病菌和黄瓜灰霉病菌的抑制率明显高于阳性对照啶酰菌胺。
以其中抑制效果最好的油菜菌核病菌为靶标，开展了毒力测定、菌核形成及萌发影响试验。结果表明：优化发酵方法后所得TCS007菌株粗提发酵产物对油菜菌核病菌的EC50值为0.51μg/mL，初始发酵方法所得粗提发酵产物的EC50值为17.91μg/mL，优化后活性提高了35倍。说明采用优化后的发酵方法能够产生更多具有抑菌活性的次生代谢产物。
优化发酵方法后所得TCS007菌株粗提发酵产物对油菜菌核病菌菌核形成的影响结果。培养15 d后，在EC50值0.51μg/mL质量浓度下，TCS007菌株粗提发酵产物处理组菌核数量明显低于对照组，抑制率为63.93%，可显著减少油菜菌核病菌菌核的形成。
采用优化后发酵方法所得TCS007菌株粗提发酵产物对油菜菌核病菌菌核萌发的影响结果。培养12 h时，空白对照组菌核开始萌发，但0.51μg/mL TCS007菌株粗提发酵产物处理组对菌核萌发的抑制率为100%，说明在前12 h该粗提物可完全抑制菌核的萌发；培养24 h后，所有处理组菌核均开始萌发，且随培养时间延长菌核萌发数逐渐升高；培养48 h时，所有处理组中菌核萌发率均达到了100%。据此可知，TCS007菌株粗提发酵产物对油菜菌核病菌菌核萌发有一定的抑制作用，但这种抑制作用仅在萌发初期有效，表明TCS007菌株粗提发酵产物能够抑制油菜菌核病菌菌核的萌发，且主要作用为推迟菌核的萌发时间。
3结论与讨论
棘孢木霉TCS007菌株能够产生具有抑菌活性的次生代谢产物，这是其作为有益微生物应用于生防领域的重要前提。木霉属真菌对数量庞大的植物病原真菌、细菌甚至病毒具有广谱的生物活性，可用于植物病害的生物防治领域，也是目前开发产品最多的植物病害生防菌。木霉可产生多种不同类型的次生代谢产物，而这些物质即是木霉抗生素类作用活性的主要物质基础。木霉活菌制剂由于货架期短、使用剂量高以及产品稳定性差等因素，限制了其广泛应用。然而，木霉的次生代谢产物却可能与化学制剂一样，具备良好的产品稳定性和较长的货架期。因此，在植物病害生物防治领域，利用木霉的次生代谢产物研究开发新型杀菌剂，无疑有着巨大的科研与应用价值。
王晗昕通过单因素试验和响应曲面法优化，显著提高了蓝木霉(Trichoderma caerulescens)TW21990-1色素粗提发酵产物的产量。本研究同样通过单因素试验和响应曲面法，优化了棘孢木霉TCS007菌株的固态发酵条件，结果表明：培养时间、黄豆粉添加量和加水量是影响粗提发酵产物产量的3个关键因素。优化后的培养基及发酵条件为：大米72 g，培养时间29 d、黄豆粉添加量3.5%、加水量47 mL、光照周期12 h/12 h、培养温度28℃、接种量1 mL(孢子浓度1×107个孢子/mL)、初始pH 7.0。在此最优发酵条件下，粗提发酵产物的产量为1.21 g，采用浅盘发酵法进一步扩大发酵，粗提发酵产物产量可达1.45 g，较初始发酵方法所得粗提发酵产物产量提高了1.61倍。Kaur等也曾以大米作为培养基底物发酵木霉菌株，结合统计建模，结果表明：通过响应曲面法优化可显著提高发酵产物产量和抗真菌活性。陈书峰等通过浅盘发酵也显著提升了绿色木霉(Trichoderma viride)的纤维素酶产量。
以优化后的培养基不接种TCS007菌株作为培养基对照，发现培养基对照所得粗提发酵产物在4μg/mL质量浓度下对油菜菌核病菌几乎不存在抑制活性，而优化发酵方法后所得TCS007菌株粗提发酵产物对油菜菌核病菌的抑制活性显著增强，EC50值为0.51μg/mL，比初始条件下的粗提发酵产物(EC50值17.91μg/mL)提高了35倍。许铭玉等发现，在培养基中添加质量分数2.5%的黄豆粉时，所得TCCC 21101菌株发酵滤液的抑菌活性最高。本研究所得结论与之类似，表明优化发酵培养条件不仅可提高活性代谢产物的产量，还可能促进了新的抑菌活性物质的产生，而这些活性代谢产物并不是由培养基本身产生的。
木霉属真菌产生的代谢产物抗菌谱广，例如已明确的6-戊基-2H-吡喃-2-酮、绿胶霉(viridin)及木霉素等均可抑制多种植物真菌病害。本研究中优化发酵方法后的TCS007菌株粗提发酵产物在50μg/mL质量浓度下，对油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、苹果褐斑病菌和黄瓜灰霉病菌的抑制率在62.50%~96.87%之间，值得注意的是，其中对苹果褐斑病菌和黄瓜灰霉病菌的抑制率甚至高于阳性对照啶酰菌胺。此外，优化后所得TCS007菌株粗提发酵产物对油菜菌核病菌菌核形成的抑制率可达63.93%。王琳的研究表明，由化学合成所得的斑蝥素衍生物(cantharidin derivatives)对核盘菌有一定抑制作用，能推迟其菌核萌发时间，但不能抑制菌核的最终萌发。本研究结果与之类似，棘孢木霉TCS007菌株粗提发酵产物在EC50浓度下对油菜菌核病菌的菌核萌发也有一定抑制作用，但同样仅在萌发初期有效。
综上，本研究表明，棘孢木霉TCS007菌株的代谢产物在生物防治领域具有广阔的研究及应用前景，所得结果可为海洋木霉资源的进一步开发及绿色可持续农业的推进提供重要参考，关于TCS007菌株粗提发酵活性产物的具体化学成分及结构有待进一步研究，未来可通过液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)以及基因组学等手段深入解析其活性成分。此外，TCS007菌株固态发酵大规模生产所得产物的稳定性以及田间应用效果等均有待进一步验证。