脂肽对蜜蜂球囊菌生长抑制作用及其孢子萌发的影响（三）
2.2体外抑菌试验结果
2.2.1抑菌圈试验
由图3可知，Iturin和Fengycin对蜜蜂球囊菌有抑制作用,Iturin的抑制作用最强,抑菌圈半径达8.53 mm,其次是Fengycin,抑菌圈半径为5.84mm,Surfactin对蜜蜂球囊菌无抑制作用。Iturin抑菌效果最好，选其进行后续试验。
2.2.2 MIC和MFC测定
由图4可知，Iturin浓度为0.2~3.13μg/mL时，蜜蜂球囊菌D₆₀₀nm值较高;Iturin浓度为3.13~25μg/mL时,D₆₀₀nm值持续变低;当Iturin浓度>25μg/mL时，达到最大抑菌效果。累积分布率统计表明，Iturin浓度为3.13μg/mL时，可抑制2株菌株(累积分布率2/55);浓度升至6.25μg/mL时，抑菌范围扩大至26株，使累积抑菌株数达28株(累积分布率28/55),确定Iturin对蜜蜂球囊菌的MIC₅₀值为6.25μg/mL。Iturin浓度为25μg/mL时，所有受试菌株均被抑制(累积分布率55/55)，确定Iturin对蜜蜂球囊菌的MIC₉₀值为25μg/mL(表2)。
MFC试验中阴性对照没有蜜蜂球囊菌生长，阳性对照蜜蜂球囊菌全部生长，Iturin浓度为6.25、12.5、25μg/mL时蜜蜂球囊菌生长，Iturin浓度为50、100μg/mL时无蜜蜂球囊菌生长，Iturin对蜜蜂球囊菌的MFC是50μg/mL(表3)。
表2 Iturin对蜜蜂球囊菌的MIC
表3 Iturin对蜜蜂球囊菌的MFC
2.3抑菌机制探究
2.3.1 Iturin对蜜蜂球囊菌孢子的影响
由图5可知,与对照组相比,Iturin各浓度组蜜蜂球囊菌孢子萌发率均显著下降(P<0.05)。PI染色结果显示,对照组中孢子几乎未被染色;随着Iturin浓度增大,被PI染色的孢子(红色荧光斑点)数量逐渐上升,当Iturin浓度为50μg/mL时,大量孢子被染色,呈现出强烈的红色荧光反应(图6)。
2.3.2 Iturin对蜜蜂球囊菌细胞膜的影响
由图7可知,随着Iturin浓度的升高,麦角甾甾醇含量逐渐降低。与对照组相比，当Iturin浓度为12.5、25和50μg/mL时,麦角甾甾醇含量分别下降了52.18%、60.69%和67.12%,差异显著(P<0.05)。
2.3.3 Iturin对蜜蜂球囊菌细胞壁的影响
由图8可知,与对照组相比,Iturin各浓度处理组几丁质含量分别下降了17.39%、22.58%、30.69%和32.94%,25和50μg/mL Iturin组几丁质含量显著低于对照组(P<0.05)。
3讨论
本研究通过形态学与分子生物学方法对分离菌株进行了鉴定。结果显示，分离菌株在PDA培养基上形成典型的白色绒毛状菌落，显微观察可见具有隔膜的分枝状菌丝结构。其孢子呈椭圆形，大小为(2.8~2.9)μm×(1.4~1.5)μm,孢子囊直径为69~80μm,与余林生等报道的蜜蜂球囊菌特征一致。经分子生物学鉴定显示，菌株18S rDNA PCR扩增获得大小约600bp的特异性条带，与戚伟等研究中报道的一致。测序结果与GenBank数据库中蜜蜂球囊菌(登录号:GQ867785.1)相似性达100%。该综合鉴定方法确保了菌株鉴定的准确性。
抑菌试验结果显示，Iturin抑菌效果呈现明显的浓度依赖性，3.13~25μg/mL范围内抑菌作用逐渐增强，25μg/mL时达到最大效果。孢子萌发抑制试验证实其抑制率与浓度呈正相关(6.25~50μg/mL)。相比对其他病原菌的MIC值(镰刀霉51.8μg/mL,灰葡萄孢霉37.0μg/mL),Iturin对蜜蜂球囊菌显示出更强的抑制活性，表明其具有高效、广谱的抗真菌特性。
麦角甾甾醇作为真菌细胞膜的重要组成成分，在维持细胞膜的流动性、通透性和稳定性等方面具有重要作用。本研究发现，Iturin处理可显著降低蜜蜂球囊菌细胞膜麦角甾甾醇含量。试验结果显示，当Iturin浓度≥12.5μg/mL时，麦角甾甾醇含量较对照组下降52.18%~67.12%，表明Iturin可能干扰真菌细胞膜的生物合成。现有研究表明，Iturin的膜破坏作用具有多靶点特征。首先，抑制NADPH氧化酶诱导氧化应激;其次，激活钾通道致K⁺失衡，上述机制与本研究中观察到的麦角甾甾醇含量降低现象具有潜在关联性。此外，还可直接破坏磷脂双分子层结构，这一观点与本研究中检测到的膜通透性改变结果相呼应。这些机制导致细胞膜状态发生改变，最终引发细胞凋亡。
几丁质作为真菌细胞壁的主要结构成分，在维持细胞形态和机械强度方面起着关键作用。本研究发现，Iturin处理可显著影响蜜蜂球囊菌细胞壁几丁质的含量，表明Iturin能有效干扰细胞壁结构。基于本试验结果，结合现有文献报道，推测Iturin可能通过以下机制影响细胞壁合成:几丁质含量的显著降低提示Iturin可能干扰了几丁质合成酶的活性;细胞壁机械强度的下降表明β-1,3-葡聚糖的合成可能也受到抑制;细胞壁合成相关基因的表达调控可能受到影响，MAPK信号通路调控机制为此提供了可能的解释路径。故Iturin可通过多重分子机制破坏细胞壁稳态，最终导致细胞壁结构缺陷和机械强度下降。这种多靶点作用模式使真菌细胞难以维持正常形态和渗透压平衡，进而抑制菌丝生长和孢子萌发等关键生理过程，最终引发细胞凋亡。
综上所述，本研究揭示了Iturin对蜜蜂球囊菌的抑菌活性及其机制，为新型抗真菌剂的研发提供了重要理论依据。这些研究成果不仅拓展了Iturin对蜜蜂球囊菌抑菌机制的深入了解，更为蜜蜂球囊菌病害防控开辟了新的技术方向。在农业生产实践中,Iturin有望成为保障蜜蜂健康、维护生态平衡的重要技术手段，对促进蜂业可持续发展具有重要的理论意义和应用价值。未来研究可进一步结合体内试验和田间应用,深入评估其实际应用效果,加速推进相关技术的产业化进程。
4结论
本研究从患白垩垩病蜜蜂幼虫中成功分离纯化蜜蜂球囊菌，脂肽Fengycin和Iturin可抑制蜜蜂球囊菌菌丝生长，Iturin作用效果最好，Surfactin无抑制作用。Iturin在48h对蜜蜂球囊菌的MIC₅₀、MIC₉₀和MFC分别为6.25、25和50μg/mL。Iturin可有效抑制菌丝生长、蜜蜂球囊菌孢子萌发，并破坏细胞膜和细胞壁。
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