银杏黑斑病和轮纹病病菌生长、产孢试验和孢子萌发试验（一）
摘要对银杏黑斑病菌(Alternaria tenuis Ness)和轮纹病菌(Pestalotia ginkgo Hori)进行生长、产孢条件和孢子萌发试验。结果表明，银杏黑斑病菌生长、产孢温度为10℃~35℃，25℃生长最好，35℃产孢最多，20℃~35℃孢子萌发良好；轮纹病菌生长温度为10℃~30℃，最适25℃，10℃下不产孢，20℃孢子萌发率最高。2种菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长旺盛，在相对湿度(RH)65%~98%生长良好，且加大RH有利于分生孢子形成，RH 100%+水滴处理孢子萌发率最高。2种菌生长的pH值为2~11，偏酸性利于分生孢子萌发。葡萄糖、叶汁有促进轮纹病菌分生孢子萌发作用；光照对黑斑病菌的生长和产孢没有显著影响，但能促进轮纹病菌孢子形成。
银杏黑斑病和轮纹病是银杏成株期叶片的主要病害，几乎遍布所有的产区。在广西银杏产区内，由于推广应用早实丰产技术，进行大面积集约化栽培，银杏品种资源进一步单一化，这2种病的危害越来越大，严重地影响了银杏果实的数量和质量、以及银杏叶黄酮类物质的提取和系列产品加工。黑斑病和轮纹病常相伴发生，为了探讨其发生规律，更有效地进行防治，本文对2种病菌的生物学特性进行生长、产孢试验和孢子萌发试验。
1 材料
1.1 供试菌株
黑斑病菌(A.tenuis)和轮纹病菌(P.ginkgo)菌株，根据文献进行分离鉴定，纯化、培养备用。
1.2 培养基
PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)、WA(水琼脂培养基)、GLA(银杏叶汁葡萄糖琼脂培养基。将45片健康的银杏叶，加10mL蒸馏水，于研钵中研磨，用纱布过滤，与溶化的500mL葡萄糖琼脂液混合均匀，分装后灭菌)。
1.3 培养液
1%葡萄糖液、银杏叶汁培养液(将银杏叶汁用蒸馏水稀释)、无菌水。
2 方法
2.1 病原菌生长和产孢试验
2.1.1 温度试验
将2种菌株分别在PDA平板上复壮培养3d~4d，用灭菌的打孔器(直径4mm)打取菌落边缘的菌块，移植到PDA平板上，置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒温箱中培养，每处理4次重复。
每2d测1次菌落生长直径，并记录菌落形态、颜色变化、分生孢子开始形成的时间等。黑斑病菌培养15d，从每个处理中随机抽取一皿，用打孔器(直径7mm)打取菌块(鉴于黑斑病菌产孢量大)，用10mL蒸馏水将孢子洗下，加1~2滴Tween-80，振荡摇匀，制成均匀的孢子悬浮液，从中取4滴于载玻片上，在20×10倍显微镜下镜检，每滴计测9个视野的孢子数，取其平均值，进行方差分析，统计各处理间的差异显著性。轮纹病菌培养30d，从每处理中随机抽取一皿，用10mL蒸馏水将孢子洗下，制成均匀的孢子悬浮液。检测和分析方法同黑斑病菌。
2.1.2 湿度试验
菌块按2.1.1移植方法，置于用不同浓度的H₂SO₄控制不同湿度的密闭容器中培养，设4个处理：RH 65%、RH 75%、RH 85%、RH 98%，每处理4次重复，培养温度25℃。观测方法和记录项目同2.1.1。
2.1.3 培养基试验
用接种环轻取复壮好的菌丝，移植到PDA、WA、GLA培养基中培养，每处理4次重复，培养温度25℃。观测方法和记录项目同2.1.1。
2.1.4 酸碱度试验
用1M HCl和1M NaOH将PDA培养基调配成6个不同pH值：2、4、5、7、9、11，按2.1.1方法移植接种，每处理4次重复，于25℃条件下培养。观测方法和记录项目同2.1.1。
2.1.5 光照试验
菌块移植方法同2.1.1，先置于25℃恒温箱中培养4d~5d，然后分别进行完全黑暗(用黑色塑料袋套住)、自然光照射、日光灯照射共3个处理，每处理4次重复。观测方法和记录项目同2.1.1。
2.2 孢子萌发试验
2种菌分别在PDA培养基上复壮培养约1个月，分别用10mL无菌水将孢子洗下，加1~2滴Tween-80，摇匀，稀释制成均匀的分生孢子悬浮液，浓度是在10×10倍显微镜下每视野约80个孢子。
| 温度 Temperature (℃) | 黑斑病菌(A.tenuis) | 轮纹病菌(P.ginkgo) | ||||||||||
| 生长速度 Growth velocity (mm/d) | aa05 | αa01 | 产孢量 Conidial production (个/视野) | 00.05 | α0.01 | 生长速度 Growth velocity (mm/d) | aa05 | aa01 | 产孢量 Conidial production (个视野) | α0.05 | αa01 | |
| 10 | 2.60 | d | D | 8.4 | d | C | 3.15 | e | E | 0 | c | C |
| 15 | 4.15 | c | C | 11.0 | bc | B | 4.84 | d | D | 23.0 | b | B |
| 20 | 5.03 | b | B | 5.8 | e | D | 5.47 | b | B | 48.4 | a | A |
| 25 | 5.66 | a | A | 120 | b | B | 7.88 | a | A | 44.0 | a | A |
| 30 | 4.70 | b | BC | 10.6 | c | B | 5.15 | c | C | 22.7 | b | B |
| 35 | 2.78 | d | D | 25.1 | a | A | 0 | f | F | 0 | c | C |
表1不同温度对黑斑病菌和轮纹病菌生长和产孢的影响
2.2.1 温度试验
用吸管吸取孢子悬浮液，滴于载玻片上，加盖玻片，置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒温箱中保湿培养，每处理4次重复，分别于8h、24h进行镜检，每处理计测500个以上分生孢子的发芽率，取其平均值，进行方差分析，统计各处理间的差异显著性。
2.2.2 湿度试验
设4个处理：泡水(在培养皿中加5mm深的分生孢子悬浮液)，以及将分生孢子悬浮液滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于用浓H₂SO₄控制不同相对湿度RH 90%、RH 100%、RH 100%+水滴的干燥器中培养，经8h、24h镜检孢子的发芽情况，每处理4次重复，培养温度为25℃。
2.2.3 酸碱度试验
用1M HCl和1M NaOH将分生孢子悬浮液调配成2、4、5、7、9、11共6个不同的pH值，用吸管分别吸取，滴于载玻片上，置于25℃恒温箱中保湿培养，每处理4次重复。
2.2.4 培养液试验
分别用无菌水、1%葡萄糖液、银杏叶汁培养液配制成3种分生孢子悬浮液，并将浓度调至在10×10倍显微镜下每视野约80个分生孢子，滴于载玻片上，于25℃恒温箱中保湿培养。
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