水貂肠道乳酸杆菌RSJ生长曲线及产酸、药敏试验结果（二）
1.2.8抑菌试验
将致病性大肠杆菌和沙门氏菌分别接种于营养肉汤中，37℃，180 r/min过夜培养后，稀释菌液浓度至0.5个麦氏比浊单位，将已灭菌的普通培养基加热到完全融化，倒在培养皿内(每皿15 mL)，待其凝固。此外，将融化的普通培养基冷却到50℃左右加入致病菌株，将混有菌的培养基5 mL加到已凝固的培养基上待其凝固。然后以无菌操作在培养基表面垂直放上牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入乳酸菌发酵液。置于37℃培养16～18 h，然后用测量抑菌圈直径，计算其平均值。
1.2.9安全性试验
选取体重18～22 g的昆明系小白鼠10只，随机分组，每组5只。按3.6×108CFU/mL的剂量对空腹8 h后的试验小鼠每天每次经口灌胃0.3 mL，同时设空白对照组。每天观察和记录，14 d结束试验后，剖检观察内脏及其它组织器官有无变化。
2结果
2.1菌落形态及镜检结果
菌落形态为中央凸起、边缘整齐、黄色或白色半透明状菌落。镜检为革兰氏阳性菌，菌体形态为杆状，多数呈链条状排列(如图1)，命名为RSJ。
2.2生化试验鉴定结果
分离菌的触酶试验、吲哚试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验等皆为阴性(见表1)，根据RSJ菌的菌落、镜检形态和生化试验，参照文献初步鉴定为乳酸杆菌属(Lactobacillus)。
图1 RSJ的菌落形态与革兰染色镜检(×1000)
2.3 PCR鉴定结果
用乳酸杆菌属特异性引物对菌株RSJ进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示在223 bp处有特异性条带(图2)。
将分离的RSJ菌株的测序结果与其他17个从GenBank获取的乳酸杆菌属的核酸序列进行同源性比较。结果显示比对的几个菌株的同源性在91.2%～94.7%之间(图3)，RSJ菌株被鉴定为乳酸杆菌属。
2.4耐酸试验结果
对RSJ菌株进行不同pH生长情况试验，判定试验结果标准是依据营养肉汤培养基底部是否有白色沉淀，如果有白色沉淀，摇动呈浑浊状，说明菌株在此培养条件下能够进行繁殖生长。结果表明，pH 2.0和3.0时，培养液摇匀后清澈，菌株在此pH基本不生长；pH 4.0时，培养液微混，菌株生长，但生长不好；pH 5.0和6.0时，培养液底部的有白色沉淀，摇匀后浑浊，菌株生长良好(图4)。
表1 RSJ的生化试验鉴定结果
2.5生长曲线和产酸试验
由图5看出，菌株RSJ在6 h开始进入对数期，前18 h菌株繁殖较快，OD600值持续生长，此时pH急速下降；从18～36 h，OD600值趋于平稳在1.670，pH趋于3.98，菌株维持在稳定期。
图2菌株RSJ的16S rRNA基因PCR扩增结果
图3 RSJ与其他菌株核酸序列的同源性比较结果
图4菌株RSJ的耐酸试验结果0.不接菌对照；2-6.不同pH培养基培养；7.接菌对照
2.6药敏试验结果
用标准敏感菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923(S.aureusATCC25923)作为质控菌，试验菌对抗生素的药敏性参照WHO提供的NCCLS的标准进行判断。对菌株进行了药敏试验，得到菌株对16种抗生素的药敏结果见表2。由表2知，菌株RSJ对青霉素、庆大霉素和环丙沙星等有一定的耐药性，其中对青霉素和环丙沙星的耐药性较强，对其余抗生素则表现为敏感。
2.7抑菌试验结果
菌株RSJ对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为8.3 mm，对大肠杆菌的抑菌圈为9.5 mm。
图5菌株RSJ的生长曲线和产酸曲线
2.8安全性试验结果
经14 d灌服观察，小鼠生长状况良好，无死亡现象；剖检内脏组织器官无肉眼可见异常变化，说明菌株RSJ对小鼠无毒性。
3讨论
使用益生菌，首要问题是要考虑其定植性，活菌在体内定植是极为复杂的，具有宿主种属特异性。所以，筛选菌种时，应尽量选用来自该动物属宿主分离的正常菌群，这样菌株进入动物体内才较易存活，并能与致病菌抢夺附着点，具有很强的竞争优势。本试验采取健康成年母貂的新鲜肠粘膜和粪便，利用改良MRS培养基进行培养，通过形态特征、生理生化反应，结合16S rRNA分子生物学鉴定，鉴定出1株乳酸杆菌RSJ，并对RSJ菌株的生长情况和安全性等生物特性进行了研究。
表2 RSJ的药敏试验结果
注：R.耐药；M.中敏；S.敏感。
传统的细菌鉴定方法试验周期长、工作量大、试验结果依赖人的主观判断。近年来，逐步建立起来的16S rRNA序列分析方法，通过提取样品中微生物的总DNA，直接从核酸水平对样品进行分析研究，为细菌的分类、鉴定提供了新的研究方法。据孙晓雯等报道，从猪粪便中分离得到一株新饲用乳杆菌，对其16S rDNA基因进行了测序并进行BLAST比对，和16S rDNA序列分析鉴定为约氏乳杆菌。陈丽园等通过对菌体形态特征、菌落特征和生理生化特性的分析，最终将1株抗鸡沙门氏菌的乳酸菌归类为乳酸乳杆菌亚军。
从水貂体内分离到的菌种制成微生态制剂对促进水貂的生长会有较为明显的效果。本试验分离的菌株来自健康的水貂肠道，理论上讲，能够很好地适应水貂肠道。本试验只对乳酸杆菌进行了属的鉴定，还需要对其进行种鉴定，以及对其在水貂上的安全性试验以及效果等方面有待于进一步研究。
4结论
从水貂肠道分离的1株优势菌株(RSJ)，为乳酸杆菌属。RSJ在10 h进入对数期，前22 h菌株繁殖较快，pH急速下降；22～36 h，菌株维持在稳定期；其对青霉素和环丙沙星的耐药性较强；对小白鼠安全无毒，且对酸环境有一定的耐受性，其代谢产物对致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，具备了益生菌的基本条件。
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