二、结果

1.7种淋球菌选择性培养基的初步评估：1号淋球菌在自制培养基及7种商品化培养基上均能密集生长；2号淋球菌在7种商品化培养基中的生长均不如自制培养基；自制培养基及巧克力平板（淋球菌）、MTM琼脂平板、一次性GC琼脂培养基及淋球菌琼脂平板均能完全抑制黏液奈瑟菌的生长；自制培养基对粪肠球菌生长的抑制效果较差，淋球菌（T-M）选择培养基能完全抑制粪肠球菌的生长；混合菌在自制培养基及淋球菌分离培养板、淋球菌（T-M）选择培养基、巧克力平板（淋球菌）、MTM琼脂平板及一次性GC琼脂培养基等培养基上分离效果较好，呈现淋球菌菌落大、杂菌小或无杂菌。5株淋球菌质控菌株在7种商品化的淋球菌选择性培养基与自制淋球菌选择性培养基培养的结果见表1。

培养基	1号淋球菌	2号淋球菌	黏液奈瑟菌	粪肠球菌	混合菌*
自制淋球菌选择性培养基	菌落较大,无色半透明,1区++++,3区分出单个菌落	菌落较大,无色半透明,1区+++,3区分出单个菌落	-	灰白色,++++,3区分出单个菌落	淋球菌大,杂菌小,2、3区分出单个菌落
淋球菌分离培养板	菌落较小,无色半透明,1区+++,3区分出单个菌落	菌落较小,无色半透明,1区++,2区分出单个菌落	+	较透明,++++,3区分出单个菌落	淋球菌大,杂菌小,2、3区分出单个菌落
淋球菌(T-M)选择培养基	菌落较小,无色半透明,1区+++,3区分出单个菌落	++,2区分出单个菌落	++ ~ +++	-	纯淋球菌,无杂菌
巧克力平板(淋球菌)	菌落较小,无色半透明,1区+++,3区分出单个菌落	++,2区分出单个菌落	-	++++,3区分出单个菌落	淋球菌大,杂菌小,2、3区分出单个菌落
淋球菌选择培养基	菌落较小,无色半透明,1区+++,3区分出单个菌落	++,2区分出单个菌落,3区2个菌落	++	++++,3区分出单个菌落	淋球菌小,杂菌大,2、3区分出单个菌落
MTM琼脂平板	菌落较大,灰白色,1区+++,3区分出单个菌落	++,2、3区分出单个菌落	-	++++,3区分出单个菌落,有溶血环	2区分出单个淋球菌,3区无淋球菌,只有杂菌
一次性GC琼脂培养基	菌落较小,无色半透明,1区+++,3区分出单个菌落	++,2、3区分出单个菌落	-	++++,3区分出单个菌落	淋球菌大,杂菌小,2、3区分出单个菌落
淋球菌琼脂平板	菌落较小,无色半透明,1区+++,3区分出单个菌落	++,2、3区分出单个菌落	-	++	菌落较小,1区3个杂菌,2、3区无杂菌
注:生长情况,“+”:1~10个菌落(稀疏生长);“++”:11~100个菌落(中等生长);“+++”:>100个菌落,但未融合(密集生长);“++++”:菌落融合成片(无法计数);-:无菌生长。“混合菌,含1株淋球菌(编号ATCC49226)和1株粪肠球菌(编号ATCC29212)

2.CO₂依赖型淋球菌的筛选：在CO₂环境下，16株淋球菌均呈现出良好的生长状态（菌落融合成片）。无CO₂条件下，11株的生长受到明显抑制，表现为菌落数量显著减少或无菌落生长；5株（ATCC49226、WHOG、NJ08-94、NJ08-112、NJ08-118）在无CO₂环境下仍有一定数量的菌落，但数量明显少于有CO₂环境下的生长结果。

3.4种保存液保存淋球菌的效果观察：淋球菌在4种保存液中-70℃保存1周至12个月，培养菌落均融合成片，保存效果未见差异。在-20℃条件下，不同保存液的性能可存明显，30%甘油胰酶大豆肉汤保存效果最好，3个月时可存活，6个月时仍有少数存活；其次为20%甘油脑心浸液，3个月时可存活；10%甘油小牛血清保存1个月时仅部分存活；10%二甲基亚砜小牛血清保存效果最差，2周时仅部分存活。

4.淋球菌不同保存方法的效果：未冻干的淋球菌在4℃、-18℃、-29℃、-70℃和液氮下的保存时间存在差异，4℃保存4 d即无淋球菌存活；-18、-29℃下，1个月时仅分别见10、12个菌落；在-70℃和液氮中保存6个月仍可存活（菌落融合成片）。冻干后的淋球菌在4℃、-18℃、-29℃、-70℃保存6个月仍可存活（菌落融合成片），25℃可保存1个月，37℃可保存3 d（菌落融合成片）。

三、讨论

目前淋球菌的检测方法主要有直接镜检法、分离培养法和核酸扩增检测法等，分离培养法仍是淋球菌检测的“金标准”，且可同时进行淋球菌耐药实验。高质量的淋球菌选择性培养基是临床获得分离淋球菌成功的至关重要因素之一。目前常用的淋球菌培养基通过添加抗生素抑制杂菌的生长，但部分种类的抗生素（如万古霉素）对淋球菌生长也有影响。本研究中淋球菌在7种商品化培养基中生长存在差异，不排除其他抗生素引起的淋球菌生长受到抑制。

混合菌主要用于验证淋球菌选择性培养基对杂菌的抑制能力以及实验技术人员对淋球菌的分离鉴定能力。不同种类淋球菌选择性培养基对杂菌的抑制能力各不相同，直接干扰实验技术人员对淋球菌的分离鉴定水平[4]。此外，随着淋球菌耐药菌株的不断出现，对淋球菌培养基的配方提出了更高的要求，商品化的淋球菌培养基质量有待进一步提高。

烛缸培养是一种简单、经济的培养方法，尤其适用于资源受限的偏远及基层医疗机构[5]。无论淋球菌参考菌株还是临床分离株，都需依赖一定量的CO₂环境才能生长，只有极少数淋球菌在培养时不依赖CO₂的环境[3]。因此，在开展淋球菌培养时，需确保培养成本放入烛缸后的密闭性，以免影响淋球菌的培养结果，造成假阴性。

淋球菌是一种苛养菌，其营养要求高，培养和保存较难。对于淋球菌的长期保存，建议使用-70℃条件下的任何一种保存液，尤其是20%甘油脑心浸液，其在-20℃下也有较好的保存效果。对于基层医疗单位在实验室条件有限的情况下，30%甘油胰酶大豆肉汤是比较实用的保存方法。本次研究只对淋球菌少量参考菌株和临床分离株进行了保存效果观察，对于淋球菌大样本的保存效果仍需要进一步研究。

菌种保存方法有多种，如固体培养基保存法、半固体穿刺保存法、干燥保存法及超低温保存等[6]。理想的菌种保存不仅要维持菌株的活性，还需确保菌株固有的生物学性状及抗原特性。淋球菌对外界理化因子的抵抗力较弱，对热敏感，易产生自溶酶。常规的固体培养基需定期传代，操作较为烦琐并易导致菌株突变[7]，目前冷冻干燥法是淋球菌保存运输的最佳方法。对于未冻干菌株，-70℃或液氮是更优的选择；而冻干菌株在多种低温条件下均能较好保存。本研究显示淋球菌冻干后保存要优于未冻干状态保存。

综上所述，本研究主要比较淋球菌商品化培养基与自制培养基的性能、筛选CO₂依赖型菌株、评估4种自制保存液对淋球菌的保存效果以及淋球菌在冻干前后的存活情况。结果表明，淋球菌的分离培养在自制培养基及一定量的CO₂环境下能较好生长，30%甘油脑心浸液保存淋球菌的效果要优于其他保存液，超低温及冻干后保存可以提高其存活时间。本次评估仅局限于本实验室，为确保实验结果的可重复性，未来在研究开展前应进行重复性设计并做预试验，实验操作人员应熟练掌握操作流程、遵循安全规范、及时详细记录实验数据等，有条件可以开展多中心评估。

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