葡萄牙棒孢酵母J5的耐受性与发酵产物的挥发性代谢特征分析
1.3.3 葡萄牙棒孢酵母J5的耐受性测定
将J5种子液按1×106 CFU/mL的接种量接种至红谷提取物发酵基质中，调整基质成分进行发酵。考察J5对乙醇、糖、pH值和温度的耐受性。
1.3.3.1 乙醇耐受性
使用无水乙醇调节红谷提取物发酵基质的乙醇体积分数分别至0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%，30 ℃发酵48 h，利用比浊法在600 nm波长处检测发酵液的OD值，绘制乙醇体积分数-OD值的折线图，评价J5对乙醇的耐受性。
1.3.3.2 糖耐受性
添加无水葡萄糖，调整红谷提取物发酵基质糖质量浓度分别至10、20、25、30、35、40 g/100 mL，30 ℃发酵48 h，利用比浊法在600 nm波长处检测发酵液的OD值，绘制糖质量浓度-OD值的折线图，评价J5对糖的耐受性。
1.3.3.3 酸耐受性
使用HCl溶液调节红谷提取物发酵基质pH值分别至2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6，30 ℃发酵48 h，利用比浊法在600 nm波长处检测发酵液的OD值，绘制pH值-OD值的折线图，评价J5对pH值的耐受性。
1.3.3.4 温度耐受性
将发酵温度设置为20、25、30、35、40、45、50 ℃，发酵48 h，利用比浊法在600 nm波长处检测发酵液的OD值，绘制温度-OD值的折线图，评价J5对发酵温度的耐受性。
1.3.4 J5发酵实验
将J5接种于糖质量浓度为10 g/100 mL的红谷提取物发酵基质中（p H值自然），使菌种终浓度为1×106 CFU/mL。在30 ℃条件下发酵72 h，间隔24 h取样测定发酵液乙醇、总酸和有机酸含量，取发酵终点发酵液检测挥发性代谢产物。
1.3.5 葡萄牙棒孢酵母形态学观察
观察培养48 h的J5平板菌落外观，利用光学显微镜观察细胞光学显微结构。
1.3.6 生物量测定
参照方法，利用比浊法测定纯培养菌株的生物量。
1.3.7 总酸含量测定
参考GB/T 13662—2018《黄酒》测定发酵液中总酸含量。
1.3.8 发酵液中乙醇和有机酸含量的测定
参考方法。利用高效液相色谱技术测定发酵液中的乙醇和有机酸含量，采用外标法定量。
样品预处理：取1 mL发酵液于2 mL离心管中，8 000 r/min离心20 min去除细胞，吸取500 µL上清液于2 mL离心管中，加入50 µL质量分数30%硫酸锌溶液、50 µL质量分数10.6%亚铁氰化钾溶液、400 μL超纯水混合均匀，静置5 min，在10 000 r/min条件下离心5 min取上清液，经0.22 µm水系滤膜过滤，取滤液保留于液相色谱样品瓶中备用。
乙醇质量浓度测定的色谱条件：Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm）；RID检测器，检测温度40 ℃；流动相5 mmol/L硫酸溶液，流速0.6 mL/min；柱温60 ℃；进样量20 µL。
有机酸质量浓度测定的色谱条件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温30 ℃，进样量10 µL，流速1 mL/min。流动相A为甲醇，流动相B为体积分数0.2%的磷酸。梯度洗脱程序：0～5 min，1% A、99% B；5～12 min，1%～10% A、99%～90% B；12～15 min，10%～100% A、90%～0% B；15～20 min，100% A、0% B；20.01～25 min，1% A、99% B。
1.3.9 挥发性代谢产物测定
参考等方法，利用顶空固相微萃取-全二维气相色谱-四极杆-飞行时间质谱检测发酵液中的挥发性物质。
样品前处理：取5 mL样品于20 mL螺纹顶空进样瓶中，加入10 μL 24.65 μg/mL 3-辛醇（终质量浓度0.049 3 μg/mL）、3 g NaCl，密封后备用。
SPME条件：采用DVB/CWR/PDMS萃取头（固相膜厚度80 μm、长度10 mm）。样品在50 ℃条件下平衡15 min，萃取30 min，解吸5 min。
气相色谱条件：色谱柱：一维柱HP-5（30 m×0.25 mm，0.25 µm）、二维柱DB-17 ms（1.2 m×0.18 mm，0.18 µm）。进样口温度250 ℃，以不分流模式进样。柱温箱升温程序：起始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速率升温至250 ℃并保持5 min。SV系列热调制柱（适用碳数范围C6～C40），调制周期为6 s。以高纯氦气作为载气，恒流模式，流速1 mL/min。
质谱条件：采用电子电离源，电离电压70 eV，离子源温度为200 ℃，传输线温度250 ℃，检测器采集质量范围m/z 35～300，采集频率为50光谱/s。
使用Canvas软件进行谱图分析，与NIST20谱库比对并结合保留指数进行定性分析。以信噪比＞100、正反匹配度均大于700、RI计算值与文献报道值差值≤20为鉴定标准，保留3个平行中均出现的化合物，并去除因萃取头影响出现的硅氧烷类杂质峰、删除含有卤素和柱流失的化合物。
采用内标法按式（1）半定量计算挥发性物质的质量浓度，按式（2）计算挥发性物质的OAV：
1.4 数据分析
所有实验均进行3次平行，数据结果以pagenumber_ebook=117,pagenumber_book=99±s表示。使用SPSS Statistics 26软件进行独立样本t检验、方差分析和多重比较，利用迈维代谢生信云平台进行主成分分析和相关性分析，使用Origin 2024软件绘图。
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