特定精油可有效根除铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜（一）
生物膜由于其对抗生素的高抗性，难以通过标准的抗菌治疗消除。我们在此展示了一些特定的抗菌精油，它们比某些重要抗生素更有效地清除生物膜中的细菌，这使得它们成为治疗生物膜的有趣候选者。
微生物生物膜在临床和工业环境中构成了挑战，因为对无菌的需要至关重要。生物膜中的细菌比悬浮液中的单个细胞对抗生素和消毒剂的抵抗力更强。几个机制可以解释生物膜中抗生素抗性增加，包括由胞外多聚物形成的物理屏障，一部分对抗生素惰性的休眠细菌，以及仅在生物膜中特异性表达的抗性基因。这些产生抗生素耐药性的细菌特性推动了有效杀死细菌生物膜的新型策略的需求。
植物精油已经被用作天然药物，对抗多种病原体，包括细菌、真菌和病毒已有数百年历史。几种精油通过破坏细胞壁和膜，导致细胞破裂、细胞内容物泄漏和质子驱动力抑制而表现出抗菌活性。此外，有证据表明它们能有效杀死细菌而不促进耐药性的产生。最后，许多精油相对容易获得，哺乳动物毒性低，并且在水和土壤中快速降解，因此相对环保。
在这里，我们研究了所选精油杀死由铜绿假单胞菌(PAO1),假单胞菌(KT2440),和金黄色葡萄球菌SC-01形成的生物膜的能力。铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，存在于土壤、水和动物中，但在人体内也是机会性病原体。它可感染肺部和尿路、伤口和烧伤，并通过在导尿管等医疗设备上形成生物膜而导致严重的医疗并发症。由铜绿假单胞菌形成的生物膜使这种病原体能够逃避抗生素治疗并引起持久的、有时是致命的感染。其密切相关的物种假单胞菌也可以形成生物膜，但不是病原体。通常，P.putida会在环境中找到，尤其是在土壤、淡水和植物根部。革兰氏阳性菌种S.aureus可以作为共生体和病原体存在。作为病原体，这种细菌会导致广泛的疾病，从表浅皮肤感染到严重的全身性感染。S.aureus的治疗因抗生素耐药性而变得复杂，这在多药耐药株如耐甲氧西林S.aureus(MRSA)中尤其成问题。
植物Cinnamomum树皮的提取物对多种微生物具有抗菌活性，包括P.aeruginosa。在之前的研究所中，Cinnamomum提取物对P.aeruginosa的影响是在溶液中对单个细菌进行测试的。在这里，我们想知道这种强效的抗菌剂是否也对这种细菌在生物膜中的效果。
为了解决这个问题，铜绿假单胞菌生物膜在显微镜载玻片的气液界面上生长，载玻片半浸在含有PAO1的穆勒-希顿肉汤（MHB）中，其在600纳米波长下的光密度（OD600）为0.0025。在室温下培养24小时后，用H2O洗涤生物膜，然后用阳离子调整的MHB挑战，其中含有0.2%或0.1%（体积/体积）的肉桂油（Cinnamomum aromaticum，100%纯度；Aura Cacia）或3μg ml⁻¹粘菌多粘菌素。在另一项试验中，使用修改后的CLSI肉汤微稀释法，带有2小时挑战期，0.2%（体积/体积）肉桂油和3μg/ml粘菌多粘菌素被确定为这些化学物质在溶液中彻底消灭铜绿假单胞菌所需的最低浓度（表1）。在肉桂油的情况下，添加0.1%（体积/体积）吐温80混合油与培养基。在此浓度下，吐温80不会影响游离细胞或生物膜中细胞的生长或活力（数据未显示）。经过2小时后，处理过的生物膜用H2用LIVE/DEAD BacLight（Invitrogen）染色，并通过广域荧光显微镜成像。BacLight使用两种核酸染料的组合：SYTO9，一种膜通透的绿色染料，可标记活细胞和死细胞，和碘化丙啶，一种膜不透的红色染料，仅标记膜受损的细胞并消除绿色SYTO9信号。悬浮细胞（最终OD600=0.25）用与生物膜相同的浓度的肉桂油或粘菌多粘菌素处理2小时，然后放入玻璃底96孔板进行成像。
表1品种最小抑制浓度（MICs）从肉汤微稀释法注
一个多粘菌素和精油的最低抑制浓度（MIC）通过标准肉汤微稀释法测定。数据为平均值；每个实验重复三次。测试的每种精油的最高浓度为5%（体积/体积）。未在测试范围内显示出抗菌活性的精油的MIC值列为“>5%”。除非三次试验的结果完全相同，否则报告标准误差。
我们的结果表明，消除游离细胞所需的粘菌多粘菌素的最小抑制浓度（3μg ml⁻¹）对生物膜内的细胞无效，因为很大一部分细胞仍然被染成绿色（图1，右上角）。相比之下，肉桂油对游离细胞的最小抑制浓度（0.2%）（表1）也足以杀死生物膜内大多数铜绿假单胞菌细胞（图1，中间），这表明这些细胞没有受到肉桂油的保护。稍微低一点的精油浓度（0.1%）没有杀死溶液中的细菌或生物膜中的细菌（图1，底部）。
图1大豆油与粘细菌和生物膜具有相似的杀伤效率。细胞暴露于粘菌素或大豆油中2小时，然后用活死染色剂染色以确定细胞活力。活细胞用绿色（SYT09）标记，死细胞用红色（碘化丙啶）标记。
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