快速药物敏感性检测：荧光素酶生物发光法与微量肉汤稀释法的对比分析（一）
摘要：目的通过荧光素酶生物发光法与微量肉汤稀释法对质控菌株和临床收集菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)进行测定,探讨荧光素酶生物发光法在病原微生物快速药物敏感性试验中的应用价值。方法以D-荧光素钠、Mg2+、O2和待测菌株为荧光素酶催化反应底物,连续检测待测菌与抗生素孵育过程中相对光强度(relative light unit,RLU)变化,计算发光率并确定MIC,分析与微量肉汤稀释法的基本一致性(essential agreement,EA)和分类一致性(categorical agreement,CA)。结果荧光素酶生物发光法快速检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等质控菌株MIC与微量肉汤稀释法检测MIC结果CA和EA值均为100%;并应用该检测体系对91株临床革兰阴性菌样本、93株革兰阳性菌样本进行MIC测定,革兰阴性菌检测结果中的6种药物EA和CA分别大于90%和84%,革兰阳性菌检测结果中的6种药物EA和CA分别大于90%和80%,并使检测周期由常规药敏实验的16~24 h缩短至5~6 h。结论荧光素酶生物发光法快速检测药敏结果与微量肉汤稀释法结果具有较高一致性,且更快速、敏感,可为今后的临床检验工作提供全新的快速药敏检测方法。
病原菌生物药敏试验结果是临床医师治疗细菌性感染、合理选用药物、提高疗效和避免滥用抗菌药物的重要依据。然而，由于抗生素耐药性的普遍产生，在2017年造成20000例细菌感染患者死于细菌耐药性。因此，必须加强病原菌对药物的敏感性检测，及时准确地监测细菌对药物敏感性和耐药性的改变。目前临床普遍采用美国临床实验室标准化委员会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐的扩散法和稀释法，但这两种方法的共同缺陷是测定结果所需时间长，一般需约24~72 h。而对于感染性疾病的针对性治疗措施开展越早，对感染的控制效果也愈好。因此，建立1种快速药物敏感试验方法无论在临床疾病治疗，或是对于流行病学调查都非常必要。
荧光素酶(lucierase)是自然界中能催化荧光氧化并产生生物光的一类酶的统称。1947年，McElory发现萤火虫发光的必不可少的底物是腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，利用提取液得到荧光素酶。1985年，de Wet等又成功高效表达系统完整表达了北美萤火虫荧光素酶基因。在荧光素酶催化发光体系中，当荧光素等其它底物过量时，催化产生的相对荧光强度RLU与游离的ATP含量成正相关。而微生物胞内ATP含量相对稳定，在与青霉素、头孢类等抗生素作用后，细胞壁合成中间转肽酶结合而抑制肽聚糖的交联，致使细胞壁合成受阻，胞外水分进入菌体引起细胞肿胀、变形，最后破裂溶解而死亡。细胞破坏后，细胞中的ATP会完全释放出来，根据上述方法可以通过测量ATP的含量间接评估细菌的数量或细胞完整性，缩短检测时间，提高检测效率。因此，本研究基于荧光素酶生物发光法建立快速耐药菌药物敏感性检测体系，并将检测结果与肉汤稀释法进行对比分析，确定荧光MIC，可克服常规检测周期较长、检测滞后性的缺点，及时指导临床抗感染治疗精准用药。
1材料与方法
1.1试验菌株
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC29212、大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC29292、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853标准菌株均购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。临床验证菌株收集于郑州市中心医院临床样本，包括革兰阴性菌91株、革兰阳性菌93株。
1.2仪器与试剂
化学发光免疫分析仪LUMO(郑州安图试验仪器有限公司)，Mueller-Hinton Broth培养基(赛默飞世尔科技有限公司)，ATP标准品(Roche公司)，荧光素酶、D-荧光素钠盐(上海源叶生物科技有限公司)，Mueller-Hinton肉汤(Oxoid公司)，头孢西丁、呋喃妥因、利奈唑胺、庆大霉素、红霉素、万古霉素、美罗培南、环丙沙星、妥布霉素、阿米卡星、头孢噻肟和头孢他啶(大连美仑生物技术有限公司)，血琼脂平板(郑州安图生物工程股份有限公司)。
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