本土非酿酒酵母菌株纯种发酵动力学及对葡萄酒挥发性化合物的影响（二）
2.4.4 NS菌株酿酒学特性多元统计分析
结合各NS菌株的酿酒学参数与GC-MS结果进行层次聚类（图9a）发现，供试菌株发酵特性表现出明显的种内或种间差异。
图9酒样酿酒学参数与GC-MS偏最小二乘判别分析
注：条形图的长度代表多元回归系数，符号为正或负，即每个变量在模型中的重要性（红色字体表示特征变量）。
2株T.delbrueckii（HX-6、HX-7）被聚为一类，表明其发酵动力学、酿酒学参数及产挥发性香气化合物的能力具有较高的种内相似性。其中HX-6样品表现出更高含量与种类的挥发性化合物（图7）；2株H.uvarum（HX-1、HX-3）被聚为一类，其发酵特性也存在较高的相似性，但前期试验结果表明HX-1菌株的发酵动力学较差（图4）；2株M.pulcherrima（HX-2、HX-4）在图中明显分离，表明其处理酒样的酿酒学参数与挥发性化合物存在差异。因此，选择HX-2、HX-3、HX-4和HX-6菌株的酿酒学参数和挥发性化合物进行多元统计分析，进一步明确各代表性菌株的发酵特性差异。
对OAV大于0.1的挥发性化合物及酿造学参数进行偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。得分图9b显示，PC1解释了总方差的52.0%，PC2解释了总方差的26.0%。各处理组间分离效果明显，其中HX-6分布在PC1的正半轴，HX-2、HX-4和HX-3分布在PC2负半轴。在PC1载荷图9c中，HX-6菌株与大部分酿酒学参数与挥发性化合物的生成正相关，表明HX-6具有良好的发酵特性及产香性能。其中癸酸乙酯、色度、3-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、菌株最大生物量、香叶基丙酮、反式-橙花叔醇、2-甲基丁酸、己酸乙酯和总花色苷相关回归系数大于0.2，是区分HX-6样品和其他菌株的主要因素。PC2载荷图9d显示，HX-3菌株处理与苹果酸的生成相关性较强，表明该菌株能有效提高葡萄酒中苹果酸含量。乙醇产率、pH值是PC2上区分HX-2菌株和其他菌株发酵差异的关键指标。PC2上与HX-4菌株具有相关性的指标较少，包括还原糖剩余量、挥发酸与肉豆蔻酸乙酯。与其他菌株相比，HX-4菌株发酵酒样还原糖剩余量最高，消耗还原糖能力较差，发酵能力弱于其他3株NS菌株。
3.讨论
3.1 本土非酿酒酵母菌株的纯种发酵动力学
本试验中6株本土NS菌株均无法完全消耗‘美乐’葡萄汁中的还原糖，这主要因为随着发酵的进行，乙醇体积分数不断积累导致NS的生长和代谢受到抑制。各菌株除HX-1外其他菌株均在第9天结束发酵，发酵结束还原糖剩余为112.43～155.73 g/L，乙醇体积分数达到3.93%～6.28%。其中2株T.delbrueckii消耗还原糖能力与产乙醇能力均高于其余菌株，这与HX-6、HX-7菌株在发酵过程中的最大生物量（7.98、7.96 lg cfu/mL）明显高于其他菌株，以及酒精耐受性较强有直接相关。有研究证实，T.delbrueckii发酵能力强，纯种发酵可产高达9.38%的酒精，与本试验结果相似。2株M.pulcherrima（HX-2、HX-4）发酵动力学表现出相似趋势，糖消耗速率较慢，乙醇产量分别为4.32%、4.16%。而在张鸣宇等的研究中，不同M.pulcherrima在‘玫瑰香’葡萄汁中纯种发酵产生的乙醇含量最高为6.79%，最低为2.08%，与本研究结果存在明显差异，主要与菌株特异性与发酵条件有关。供试的2株H.uvarum发酵能力表现出一定的种属内差异，HX-1菌株在发酵第8天停滞发酵，产乙醇含量最低（3.93%），而HX-3菌株能产生5.69%的乙醇，体现出了菌株发酵能力的多元化。
3.2 本土非酿酒酵母菌株的酿造学特性差异
NS由于较差的乙醇耐受性，无法独立完成酒精发酵。在实际生产中，需要将NS菌株与S.cerevisiae混菌发酵，既可以有效避免酒精发酵迟缓或停滞，还可以改变葡萄酒的化学成分组成。比较本研究中酿酒学参数发现，虽然供试菌株中HX-7菌株还原糖利用率（51.25%）和乙醇产量（49.31 g/L）显著高于其他菌株（P＜0.05），但与商业S.cerevisiae纯种发酵相比较差。在全球温室效应不断加剧的气候条件下，葡萄果实的高还原糖含量会增加葡萄酒的潜在酒精度，对酒体的感官平衡和协调性带来挑战，因此菌株发酵过程中能够减少乙醇生成量被视为一个积极的变化。虽然本试验中HX-2（4.32%）与HX-4菌株（4.16%）的乙醇含量相对较低，但他们的乙醇产率显著高于其他菌株。说明菌株所产乙醇体积分数除与乙醇产率有关外，还与菌株细胞的生存时间、碳流流向和Crabtree效应密切相关。耐渗透压能力弱的细胞内碳流会分流自甘油合成途径，从而降低乙醇产量。甘油作为酒精发酵的主要副产物，可以提高葡萄酒的甜味，增加葡萄酒的柔和度。本试验中各菌株产甘油能力各不相同，其中HX-7、HX-6菌株产甘油能力较强，可能是菌株3-磷酸甘油脱氢酶活性较强，促进了甘油的生成。
酸度对葡萄酒口感和风味平衡至关重要。本试验中HX-1菌株发酵酒样的总酸含量最高（5.87 g/L），HX-2的总酸含量最低（5.43 g/L），其余菌株间无显著差异（P>0.05）。本试验中所有样品中检测到的挥发酸质量浓度为0.46～0.69 g/L，均小于0.80 g/L，未对酒样造成明显不利影响。各菌株间产挥发酸差异可归因于葡萄汁的成分、发酵条件以及酵母菌株自身特性。有大量研究发现，NS菌株参与发酵可有效降解葡萄酒中苹果酸的含量。但在我们的研究中发现了一个有趣现象，供试的2株H.uvarum对于提高葡萄酒中苹果酸含量均有着积极作用。LI等的研究中也发现，相比酿酒酵母纯种发酵，2株本土Starmerella bacillaris纯种发酵及与酿酒酵母共接种发酵，均提高了‘赤霞珠’葡萄酒中苹果酸的含量。后续可深入探究H.uvarum的苹果酸代谢调控途径及关键基因，为实现葡萄酒中酸度的精准调节提供分子机制参考。
不同NS菌株对葡萄酒颜色的影响，既取决于葡萄汁中多酚的种类和相对含量，还受到发酵微生物合成β-糖苷酶、花青素酶等的活力、酵母细胞壁吸附色素或者产生可能与葡萄酒中多酚反应的丙酮酸或乙醛等代谢产物的能力综合影响。有研究表明葡萄酒中总酚含量具有菌株依赖性，但也有其他作者观察到49种不同的NS菌株发酵的葡萄酒样品中总酚含量差异不大，与本试验结果一致。此外，本研究中观察到HX-6、HX-7菌株处理酒样的总花色苷含量显著高于其他处理（P＜0.05），且HX-7处理酒样色度显著高于其他处理（P＜0.05），但各处理（除HX-6外）色调值均无显著差异（P>0.05），这可能与葡萄汁成分特征相关。