微生物生长曲线分析系统：HU0460代谢产物对马铃薯黑胫病菌抑制机理
1.2高活性内生真菌的筛选与鉴定
采集银叶树的幼嫩枝条，先后用2.5%次氯酸钠溶液和70%乙醇对茎与叶进行表面消毒，将组织剖面置于PDA培养基(每100mL含4mg硫酸链霉素和4mg青霉素)上，28~30℃倒置培养3~5d，分离纯化植物内生真菌并编号保种。
将分离纯化的内生真菌接种于固体玉米(CR)大米(RI)培养基，各2瓶，于28℃黑暗培养28d，加95%乙醇浸提过夜，过滤液用旋转蒸发仪浓缩，得到的粗提物用甲醇溶解为浓度25mg/mL。以Pat为测试菌(OD600=0.06),在NA培养基上用滤纸片琼脂扩散法评价各代谢产物的抗菌活性。复筛时每滤纸片载样量分别为62.5、125、250、375和500μg。
将筛选出的具有拮抗活性的真菌菌株 HU0460在PDA平板中活化，于28℃倒置培养3~4d,观察六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl-um bromide,CTAB)法提取HU0460的基因利用引物序列ITS1(5'-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3')进行PCR扩增，PCR反应体系(30μL)为:PerfectStartTaq DNA合成酶(10 U/μL;全式金，北京)0.5μL,高纯度dNTP(10mmol/L,全式金,北京)0.5μL,10 nmol/L引物ITS1和ITS4各0.5μL,DNA模板(10 ng/μL) 2.5μL,RNasefree ddH2O 25.5μL。PCR扩增条件为94℃预变性10 min;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经1%凝胶电泳检测后送交北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行双向测序，测序结果进行NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对;用软件MEGA7.0对测序结果进行分析，根据邻接法构建系统进化树，并结合形态观察结果确定菌株的分类地位。
1.3HU0460活性代谢产物对黑胫病菌的影响
参考白明等(2021)的研究方法并稍作修改，取HU0460菌块接种至玉米固体培养基中，共接种100瓶，于28℃黑暗培养28d后，将发酵物收集于浸提桶中，以95%乙醇浸提3次，过滤浓缩除去乙醇后得到代谢产物样品(280.0g),经正相硅胶(100~200目)柱层析，以二氯甲烷-甲醇(100:0~80:20)梯度洗脱，然后利用薄层色谱法(thin-layer chromatog-raphy,TLC)将相似流分合并主点，浓缩得到流分E1~22,同时利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)对特征峰进行收集。同上方法，以Pat为测试菌，滤纸片琼脂扩散法评价各段洗脱液的抗菌活性，以助溶剂甲醇和二甲基亚砜加设阴性对照。收集代谢产物活性组分用于后续抗菌机理研究。
HU0460玉米固体发酵的活性代谢产物(浓度为25mg/mL)用无菌水2倍稀释至15个浓度梯度，将黑胫病菌液(OD600=0.02)和梯度浓度的活性组分加至96孔板中,每孔相应加入180μL黑胫病菌液和20μL不同浓度梯度的代谢产物，设不添加代谢产物的对照组，设3个平行。将96孔板置于37℃恒温箱中培养12h。使用多功能酶标仪检测每个孔的OD600 ,使用软件 GraphPad Prism 8的 Dose-re-sponse-Inhibition程序对数据进行分析并绘制抑菌曲线，得出半抑菌浓度(half-inhibitory concentra-tion, IC50 ),并根据抑菌曲线的拐点分析代谢产物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concen-tration,MBC)。
将 Pat菌液稀释至 OD600=0.06,吸取 180μL菌液与20μL活性代谢产物加至96孔板中，使代谢产物终浓度分别为1/2MIC、MIC和MBC，同时设置不添加代谢产物的空白对照组，每个浓度梯度设3组重复。将96孔板置于丹麦Biosense公司oCelloScope微生物生长曲线分析系统中，设定为37℃，仪器自动连续扫描24h，记录菌体生物量动态变化，生成并导出生长曲线数据。使用软件GraphPad Prism8进行数据分析并绘制生长曲线。
1.4扫描电镜观察活性代谢产物对Pat形态的影响
参考曹瑶等(2021)与于艳梅(2015)的研究方法并稍作修改。将OD600为0.6的黑胫病菌液转移至10 mL离心管中，加活性流分至终浓度为1/2 MIC、MIC和MBC，同时设置无菌水的空白对照和甲醇的阴性对照，于37℃，200r/min的条件下振荡培养8h。离心收集菌体;用0.1mol/LPBS缓冲液重悬菌体，2.5%戊二醛固定，30%、50%、70%、90%和100%的乙醇梯度脱水，冷冻干燥仪冷冻干燥36h;使用LEICAEMACE600离子溅射装置喷金120s，在5kV、7.2mm、20k的条件下采用扫描电镜观察Pat菌体形态变化。
1.5 DiBAC4(3)荧光染料测定活性代谢产物对黑胫病菌膜电位的影响
参考Gao等(2018)和Fadhel等(2022)的方法，加以改进。预实验优化出荧光染料DiBAC4(3)的工作液浓度为0.001μmol/L。将Pat菌液(OD600=0.6)和活性组分添加至2 mL离心管中,设置1/2MIC、MIC、MBC3个实验组，同时设置LB空白组、对膜电位有显著影响的异丙醇阳性对照组，并设不添加菌液但加了LB培养基和染料的离心管来扣除背景荧光，离心收集菌体，用0.1 mol/LPBS缓冲液重悬后，将10μL菌悬液和1μL荧光染料混合制片后在同一参数下进行荧光显微镜观察。
另外，将180μL菌悬液和20μL相应浓度的活性组分加入到黑色不透光的96孔板中，目的是使代谢产物终浓度分别为1/2MIC、MIC和MBC,同上设置空白组和阴性对照组及异丙醇阳性对照组，用不添加菌液的孔来扣除背景荧光，均设3个重复。置37°℃恒温培养2h后，每孔加1μL DiBAC4(3)荧光染料工作液，37℃避光孵育10min，使用多功能酶标仪在激发波长488 nm/发射波长520 nm的条件下检测荧光强度。不同处理组的荧光强度需要减去对应的背景荧光值来统计分析。
1.6活性代谢产物抑制Pat的马铃薯薯块侵染实验
薯块接种参照李华伟等(2020)的方法:马铃薯选用感病品种'荷兰1号'，由广东省惠东县马铃薯产业园区冬种基地提供。取健康马铃薯洗净晾干,用75%酒精进行多次表面消毒，于超净台上用灭菌小刀将马铃薯切成直径4~5cm的薯块，取9块，置于无菌的培养皿中。染病组(Pat)取10μL黑胫病菌液(OD600=1.0)滴在薯块上，在1个薯块设3点平行实验;防病组(HU0460CR+Pat)先加25mg/mL活性代谢产物3x10μL,稍干后在相应位点滴加黑胫病菌液;以无菌水作为空白对照组(CK)。每个薯块滴3个位点，每组均做3个平行重复实验。在28℃恒温培养箱内培养24~48h，观察马铃薯块茎组织是否出现水浸软腐症状和发出腐臭味。
1.7数据处理
使用 GraphPad Prism 8.0数据处理软件对实验数据进行数据统计及差异显著性分析，P≤0.05为差异显著。
2结果与分析
2.1银叶树内生真菌活性菌株的筛选与鉴定
从银叶树的茎、叶中共分离出内生真菌6株，以 HU0458~HU0463编号命名。经玉米培养基(CR)和大米培养基(RI)固体发酵获得代谢产物12份，以黑胫病菌作为测试菌，采用滤纸片琼脂扩散法筛选出3个代谢产物对黑胫病菌具有抑菌活性，其中HU0460CR有较明显的拮抗效果(图1A)，抑菌圈半径与载样量呈正相关，粗提物载样量为500μg时抑菌圈半径为3.5cm。
图1 HU0460玉米发酵物对黑胫病菌的抑菌活性(A)及菌落形态正面(B)和背面(C)
内生真菌HU0460形态特征见图1，在PDA固体培养基上其菌落正面菌丝呈白色绒毛状(图1B)，菌落背面呈现橙红色(图1C)，菌落边缘的菌丝致密、呈树状分枝。
结合形态学观察并通过ITS测序与BLAST比对(序列检索号:OP98508)，构建系统进化树(图2)，结果显示，菌株HU0460与已发现的黑孢霉属Ni-grospora aurantiaca CGMCC3.18130处于同一发育树分枝上，有着最近的亲缘关系，因此，菌株HU0460被鉴定为黑孢属真菌(Nigrospora sp.),即Nigrospora sp.HU0460。
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