KLK5过表达促进宫颈癌移植瘤生长曲线并降低顺铂化疗敏感性的实验研究（二）
1材料与方法
1.1实验动物、主要试剂和仪器
雌性BALB/c裸鼠20只，体质量15~17 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。宫颈癌ME180-NC-KLK5细胞购自上海富恒生物科技有限公司，本课题组前期研究已基于此细胞系建立稳定转染KLK5过表达宫颈癌细胞（ME180-OE-KLK5）。DMEM基础培养基购自美国Hyclone公司，DDP购自山东思科捷生物技术有限公司，高效细胞裂解液购自上海碧云天生物科技有限公司，KLK5抗体购自英国Abcam公司，Ki67抗体购自杭州荟丹生物科技有限公司，基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）抗体、β-actin抗体和山羊抗兔二抗抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，HE染色试剂盒和免疫组织化学试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。倒置显微镜购自日本Olympus公司，Western blotting电泳仪和转膜仪购自上海天能公司，化学发光成像系统购自北京京仪集团有限责任公司。
1.2细胞培养
ME180细胞培养于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80%~90%时，按1∶3或1∶4比例进行传代。
1.3 Western blotting法检测宫颈癌ME180细胞中KLK5蛋白表达水平
弃去培养皿旧培养基，沿侧壁缓慢加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞2次。收集细胞至离心管中，在4℃离心机中5 000 r·min⁻1，离心5 min，弃去上清液，PBS缓冲液重悬细胞后，再次离心，弃去上清液。向离心管中加入适量细胞裂解液，冰上裂解30 min，每隔5 min涡旋混匀1次。4℃离心机中12 000 r·min⁻1，离心15 min，收集上清液。预留部分上清液用于浓度测定，按照蛋白上清液∶蛋白上样缓冲液＝4∶1的比例加入5×蛋白上样缓冲液，沸水中煮10 min，分装后-20℃保存。采用BCA法测定蛋白浓度。电泳电压设置为150 V，时间50 min，90 V转膜90 min。5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，室温摇床1 h。封闭后采用含吐温20的Tris缓冲盐溶液（Tris-Buffered Saline with Tween®20，TBST）洗涤3次，每次10 min。加入KLK5抗体（1∶2 000）和β-actin抗体（1∶5 000）分别在4℃冰箱摇床孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10 min。加入山羊抗兔二抗抗体（1∶2 000），室温摇床孵育1 h。TBST洗涤3次，每次10 min。在化学发光成像系统中显影成像。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。
1.4裸鼠皮下移植瘤制备和实验分组
取对数生长期的宫颈癌ME180-NC-KLK5和ME180-OE-KLK5细胞，使用PBS缓冲液调整细胞悬液密度为2×107 mL⁻1，于裸鼠右侧腋窝背部皮下注射，细胞悬液注射体积为每只裸鼠100μL。接种7 d后，若在皮下触诊发现质地坚硬且边缘清晰可辨的结节，可确认为移植瘤模型构建成功。当皮下移植瘤平均体积超过75 mm³时，将裸鼠随机分为生理盐水对照组（NC-KLK5+0.9%NaCl组）、DDP治疗组（NC-KLK5+DDP组）、KLK5过表达组（OE-KLK5+0.9%NaCl组）和KLK5过表达联合DDP组（OE-KLK5+DDP组），每组5只。NC-KLK5+0.9%NaCl组和NC+KLK5+DDP治疗组用于评估DDP对宫颈癌的疗效；OE-KLK5+0.9%NaCl组和OE-KLK5+DDP组用于评估KLK5过表达对DDP疗效的影响。NC-KLK5+0.9%NaCl组和OE-KLK5+0.9%NaCl组小鼠按照0.01 mL·g⁻1腹腔注射生理盐水，每只约0.2 mL，持续2周，每周2次，共计4次。NC-KLK5+DDP治疗组和OE-KLK5+DDP组小鼠按照5 mg·kg⁻1的比例腹腔注射DDP，每只0.2 mL，持续2周，每周2次，共计4次。于第1、5、9和14天分别给药，每2 d记录1次裸鼠的进食和活动状态、体质量及肿瘤最长径和最短径，计算各组裸鼠移植瘤体积。肿瘤体积=0.5×肿瘤最长径×肿瘤最短径2。治疗结束后24 h将小鼠脱颈处死，采用75%乙醇消毒后剥离出瘤体组织，生理盐水清洗后擦干，并对瘤体称质量。
1.5 HE染色观察各组移植瘤组织病理形态表现
收集裸鼠瘤体，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡和石蜡包埋后制成切片。石蜡切片经过脱蜡水化后，采用HE染色试剂盒进行染色，二甲苯透明并封片，于显微镜下观察并采集图像。
1.6免疫组织化学染色检测各组移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平
石蜡切片进行脱蜡水化、抗原修复和非特定点封闭后，分别进行3种抗体孵育，DAB显色、复染和封片后，于显微镜下观察并采集图像。采用Image J软件分析KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达情况，以平均光密度值代表目的蛋白表达水平。
1.7统计学分析
采用Graphpad Prism 10.1统计软件进行统计学分析。细胞中KLK5蛋白表达水平，各组裸鼠体质量、皮下移植瘤体积和肿瘤组织中KLK5、Ki67及MMP9蛋白表达水平均符合正态分布且方差齐，以x±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，2组间样本均数比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。