多杀性巴氏杆菌分离鉴定、分型、药敏试验及小鼠致病性试验（一）
摘要
旨在了解我国猪源多杀性巴氏杆菌(Pm)的流行特征和耐药情况。本研究对来自黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古、陕西、宁夏、河南的病死猪脏器进行细菌分离培养，经16S rRNA测序和kmt基因鉴定，利用荚膜分型、脂多糖基因型分型、多位点序列分型(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)等方法对Pm进行分型；通过微量肉汤稀释法分析Pm对8种抗生素的敏感性；通过Illumina PE 150对细菌全基因组测序，采用ResFinder数据库分析细菌的耐药基因，最后通过小鼠致病性试验确定分离菌株的毒力。
结果显示，分离菌在血平板上形成表面光滑、湿润、中央微凸、半透明的菌落；革兰染色可见呈红色、球状或短杆状的细菌；共获得34株Pm，荚膜A型19株(占55.88%)，荚膜D型14株(占41.18%)和荚膜F型1株(2.94%)；脂多糖基因型L3有8株，脂多糖基因型L6有26株。MLST分析得到8个MLST型，ST11为优势基因型，占比为35.29%。可将Pm分为21个PFGE谱型，菌株间具有明显的多样性。耐药性结果显示，34株Pm对多黏菌素B、四环素、氟苯尼考、氯霉素、头孢噻呋、环丙沙星、卡那霉素的耐药率分别为38.23%、35.29%、23.53%、14.71%、11.76%、8.82%、2.94%，对庆大霉素不耐药；耐药基因检测结果显示，18株Pm携带9种耐药基因，分别为tet(B)、tet(C)、tet(L)、floR、aadA14、sul2、aph(6)-Id、aph(3″)-Ib和aph(3′)-Ia。Pm荚膜A型菌株毒力强于荚膜D型菌株，经腹腔注射31.5 CFU·mL-1 PmA1菌株后的试验组小鼠死亡率为100%。综上表明，34株猪源Pm中流行血清型为荚膜A型和D型，MLST型为ST11，荚膜A型菌株毒力较荚膜D型菌株强，且PFGE分型表明菌株间存在多样性，本研究为多杀性巴氏杆菌病的疫苗研发及防治提供了理论依据。
引言
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是兼性厌氧的革兰阴性菌，为短杆状或球杆状，是一种重要的人兽共患病原菌。1880年，路易斯·巴斯德首次从禽霍乱病例中分离并以其名字命名，其宿主谱广泛，能感染牛、猪、兔等多种动物。Pm在动物当中主要导致呼吸道及全身疾病，严重的可导致败血症。猪源Pm作为重要的猪病病原菌之一，可引起多种疾病，包括猪肺疫、猪传染性萎缩性鼻炎、脑膜炎和败血症等。多杀性巴氏杆菌作为经济生产型动物重要的病原菌之一，对养殖业造成了重大的经济损失。
多杀性巴氏杆菌可以分为荚膜A、B、D、E、F型5个血清型和8种脂多糖(LPS)基因型(L1~L8)。我国猪源多杀性巴氏杆菌的流行血清型随着时间的推移而发生变化，20世纪90年代之前，多杀性巴氏杆菌的流行血清型主要是荚膜A型和B型，但近十年报道，多杀性巴氏杆菌流行血清型是A型和D型。目前商品化的猪源多杀性巴氏杆菌疫苗为荚膜D型(猪萎缩性鼻炎灭活疫苗)和荚膜B型，但荚膜B型疫苗对于目前流行菌株没有保护作用，抗生素治疗仍然是治疗该疾病的主要方法，然而广泛使用抗生素造成细菌对抗菌药物的敏感性降低，尤其是对四环素类和磺胺类药物不敏感，呈现较高耐药率，多重耐药菌株不断出现，加大了临床防治难度，来自食品动物的病原菌的耐药性也是重要的公共卫生问题，对人类健康构成威胁。
分离菌株分型是了解多杀性巴氏杆菌流行病学的重要工具，除了利用两种血清型的分型方法，MLST分型和PFGE也被用于确定多杀性巴氏杆菌的遗传特征。尽管已有研究对猪源多杀性巴氏杆菌的流行病学和耐药性进行了探讨，但现有的数据以特定地区为主，缺乏全面、系统的分析，且不同地区间的耐药性不同。本研究主要以临床疑似巴氏杆菌病死猪肺组织为材料，进行Pm的分离鉴定，对分离到的Pm通过分子生物学方法进行分型、全基因组测序、药敏试验和耐药基因检测以及小鼠致病力研究，以确定其流行菌株的特征，掌握猪源Pm耐药情况和致病情况，旨在为临床治疗提供指导，防止和减少耐药菌株的传播，为猪多杀性巴氏杆菌病的防控及疫苗研发提供参考。
1材料与方法
1.1临床病料
黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古、陕西、宁夏、河南病死猪肺组织。
1.2菌株
药敏试验质控菌株：大肠杆菌ATCC 25922由本实验室保存。
1.3试剂及仪器
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