芳香化酶细胞色素P450对胶质瘤细胞生长曲线、细胞周期及分化的作用（下）
2.2 基因转染后抗性克隆的筛选
通过FuGENE™ 6 Transfection Reagent转染，经G418选择培养基培养7 d后，对照细胞全部死亡，实验组有零星成活的细胞，14 d左右可见细胞克隆形成。继续选择培养10 d后，挑取单个克隆扩增培养进行检测。
2.3 基因转染后AROM表达的检测结果
FCM结果显示，反义组和空载体组AROM的阳性细胞数都在90%左右，无显著性差异。但平均荧光强度，反义组为23.5±3.8，而空载体组为54.1±6.3，可见AROM的表达，反义组明显低于空载体组50%以上(P<0.01)，见图2，表明封闭有效。
图2 基因转染后SHG-44细胞AROM的表达的FCM检测
2.4 基因转染对SHG-44细胞的影响
2.4.1 形态学观察 倒置显微镜及HE染色下可见各组细胞呈长梭形，可呈团生长，两组转染细胞之间形态上未见明显变化。
2.4.2 生长曲线 图3所示，坐标横轴为时间(d)，纵轴为细胞吸光度值(A，波长为490 nm)，代表活细胞的数量。可见SHG-44细胞在转染了PCI/as-AROM和空载体PCI-neo后，生长规律和速度无明显变化。
图3 细胞生长曲线(测定波长490 nm)
2.4.3 细胞周期 FCM检测结果显示，转染了反义载体和空载体的SHG-44细胞的增殖指数[PI=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)]为31.3%，而空载体组的PI为31.1%，二者无显著性差异(P<0.01)。可见，两组细胞的细胞周期无明显变化。
2.4.4 转染细胞的GFAP和Vimentin的免疫荧光观察和半定量 反义载体转染组和空载体转染组的SHG-44细胞中均可见绿色免疫荧光，主要定位于胞质和细胞突起。但GFAP的免疫荧光强度较弱，经CLSM半定量测定，反义组荧光强度较空载体组减弱，由42.5±23.6降为35.8±20.3 (P<0.05)，见图4A、B。而Vimentin免疫荧光呈强阳性，经CLSM半定量测定，反义组荧光强度较空载体组明显增强，由65.9±38.6增加到82.9±43.8 (P<0.05)，见图5A、B。
图4 基因转染SHG-44细胞的GFAP免疫荧光染色(CLSM×500)
图5 基因转染SHG-44细胞的Vimentin免疫荧光染色(CLSM×500)
3 讨论
SHG-44细胞系源于人脑胶质母细胞瘤，传至100代后仍能稳定生长。有研究表明SHG-44细胞存在p24ras、c-erbB、EGF、bFGF等细胞因子及P16、P53等肿瘤蛋白异常表达和细胞周期失控，使其生长旺盛、增殖活跃，具有很高的恶性表型。关于芳香化雌激素与神经系统肿瘤细胞的相关性，我们首次发现了AROM及ER在SHG-44中有表达，并进一步证明多个AROM启动子的同时利用可能是导致AROM高表达的主要原因之一(待发表)。这一点和乳腺癌等肿瘤细胞类似，它们是否同属一类肿瘤目前尚未见文献报道。为了探讨AROM的基因表达对SHG-44细胞生长增殖及分化的影响，本实验采用反义核酸技术将重组的反义AROM真核表达质粒利用基因转染试剂FuGENE™ 6将其导入SHG-44细胞，获得能稳定表达AROM asRNA的细胞。FCM检测结果显示反义质粒转染组细胞AROM的表达明显下降(>50%)，说明反义封闭是有效的，所获得的转染细胞为后续实验提供了良好的细胞模型。
研究表明，在雌激素依赖性肿瘤中，癌细胞局部表达的芳香化酶能促进癌细胞本身的生长。例如，向稳定表达芳香化酶的乳腺癌MCF-7的工程细胞株的细胞培养液中加入AROM的催化底物雄激素，可以促进这一工程细胞株的生长，而这一促进作用可以被芳香化酶抑制剂所消除。但关于AROM基因对正常或肿瘤细胞周期调控的研究目前尚未见文献报道。本实验采用稳定表达AROM asRNA的SHG-44细胞模型为研究对象，同转染了空载体的细胞比较，结果二者之间的细胞生长曲线及细胞周期均未见明显改变，提示在神经系统肿瘤细胞中AROM的作用与外周肿瘤有所不同，可能不是促癌细胞生长的主要因素，AROM的表达与细胞周期调控蛋白之间可能也无明显的相关性。同时，也进一步提示，神经胶质母细胞瘤与乳腺癌等雌激素依赖性肿瘤可能不属于同一类。当然，由于该实验采用的反义核酸技术并不能完全封闭AROM的表达，故不能完全反映该基因的完整特性。而且SHG-44细胞仅是神经胶质肿瘤的一个细胞系，也不能完全反映肿瘤本身的特性。不过，目前为止，还尚未见AROM基因表达与神经系统肿瘤的发生、发展密切相关的文献。
就SHG-44细胞分化状态来看，中间丝蛋白与其密切相关。研究表明，SHG-44细胞中，GFAP免疫反应弱阳性，而Vimentin免疫反应强阳性，它们在胞质、胞突中具有很高的共同表达率，且二者的表达水平在星形细胞肿瘤分化和恶变过程中呈现相反的趋势。所以，GFAP及Vimentin的表达可以作为判断SHG-44细胞分化的主要指标。鉴于此，本研究通过观察AROM基因封闭后，SHG-44细胞中GFAP和Vimentin表达的变化来探讨AROM基因表达对SHG-44细胞分化的作用。结果显示，转染了反义载体的细胞较转染了空载体的细胞Vimentin免疫荧光增强，而GFAP免疫荧光减弱，提示反义AROM在一定程度上可以抑制SHG-44细胞的分化。有研究表明雌激素(E2)能诱导星形胶质细胞的分化，使未成熟的胶质细胞表达GFAP和MBP(髓磷脂碱性蛋白)。因此作者推测SHG-44中AROM的作用可能类似于E2对神经胶质细胞的促分化作用，其确切的机制还有待进一步的研究。
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