1.7 分离菌的小鼠致病性试验

昆明小鼠25只，小鼠随机分成5组(I~V)。将活化好的驴源分离菌接种于4mL THB液体培养基中，37℃培养18h，用生理盐水将菌液稀释成4个浓度组(I组:1×10⁹CFU/mL; II组:1×10⁸CFU/mL; III组:1×10⁷CFU/mL; IV组:1×10⁶CFU/mL)及1个空白对照组(V组:生理盐水)，各组按照每只0.5mL剂量进行腹腔注射。观察动物7d内的死亡状况，记录小鼠的临床症状(精神状态、被毛、饮食欲)及死亡情况，用改良Karber法计算分离菌对小鼠的半数致死量(LD50)，绘制小鼠死亡曲线，称量小鼠体质量。

1.8 分离菌的毒力基因检测

表1 毒力基因引物序列

基因 Gene	引物序列(5'→3') Primer sequence	退火温度/℃ Annealing temperature	片段大小/bp Size
lytA	F TGAAGCGGGATTATCACTGGC R GCTAAACTCCCTGTATCAAGCG	50	273
hylB	F CACCAATCCCCACTCTACTA R TGTGTCAAACCATCTATCAG	55	503
ply	F CCCACTCTTCTTGCGGTTGA R TGAGCCGTTATTTTTCATACTG	55	209
seM	F CAGAAAACTAAGTGCCGGTG R ATTCGGTAAGAGCTTGACGC	54	521
fneB	F TTTAGGAGCGTCATCATCGTTAGG R TCAGGTGGCAAGGAAGAGGTC	49	435

对驴源分离菌进行相关毒力基因鉴定，毒力基因及引物序列通过相关文献获取(表1)，主要为链球菌自溶素(autolysin of Streptococcus pneumomiae, lytA)、透明质酸裂解酶(hyaluronidase, hylB)、链球菌溶血素(pneumolysin, ply)、类M蛋白(M-like protein, seM)和纤黏蛋白结合蛋白(Fibronectin Binding Protein, fneB)，通过PCR进行鉴定。

1.9 分离菌的药物敏感性检测

将活化好的驴源分离菌、马源马链球菌马亚种(SEE-M)及标准菌ATCC9528菌液用生理盐水稀释至1×10⁶ CFU/mL。吸取100μL稀释好的菌液均匀涂布于THB固体培养基表面，采用K-B纸片琼脂扩散法，分析3株菌对氨苄西林、头孢噻肟、克拉霉素、红霉素、庆大霉素、阿米卡星、四环素、环丙沙星等药物的敏感性。设置3组平行对照，37℃孵育18~24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 疑似菌的分离及镜检结果

从48份驴鼻拭子样品中共分离出1株疑似马链球菌，分离菌在50mL/L绵羊鲜血培养基上形成针尖大小、白色半透明、有明显β溶血特征的菌落(图1-A)，革兰氏染色结果为阳性，显微镜下观察呈短链状(图1-B)。根据以上形态特征，笔者怀疑分离菌为马链球菌。

图1 分离菌菌落形态及镜检结果

2.2 分离菌16S rDNA序列扩增及测序分析

以分离菌株基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，在1466bp处出现特异性条带(图2)，测序结果通过NCBI的BLAST比对发现，分离菌与已注册马链球菌马亚种的同源性达99.01%，结合菌落形态和染色镜检结果，确定该分离菌为马链球菌马亚种。

2.3 分离菌遗传进化树的绘制及分析

用MAGE7.0绘制遗传进化树，发现分离菌与新疆马链球菌马亚种HTP133(MT815602.1)遗传距离最近(图3)，处于同一分支，将本次分离株命名为驴源马链球菌马亚种LXY019株。

图2 分离菌 16S rDNA PCR扩增结果

图3 分离菌 16S rDNA 序列遗传进化树

2.4 分离菌LXY019株的生长曲线

由生长曲线可知(图4)，LXY019株接种8h为对数生长期，8h之后稳定生长，18h后进入衰亡期，SEE-M株于前8h呈对数生长，8h后稳定生长，呈衰亡趋势，但不明显，标准菌ATCC9528在THB液体培养基内前2h生长迅速，2h后缓慢生长，20h后呈衰亡趋势。

图4 马链球菌马亚种的生长曲线(x±s, n=3)

2.5 分离菌LXY019株对小鼠的致病性试验

表2 LXY019株对小鼠的致死率

组别 Group	初始小鼠数 Number of initial mice	死亡小鼠数 Number of death mice				存活小鼠数 Number of live mice	死亡率/% Mortality
		1d	2d	3d~5d	6d~7d
I	5	5	—	—	—	0	100
II	5		2	1	2	0	100
III	5	0	0	0	0	5	0
IV	5	0	0	0	0	5	0
V	5	0	0	0	0	5	0

如表2所示，腹腔注射第1天，I组小鼠全部死亡；第2天，II组小鼠死亡2只，至第7天全部死亡；其余接种组(III组、IV组)小鼠均出现不同程度患病症状，如精神状态差，被毛粗乱，食欲废绝等，但至第7天未见死亡；V组小鼠无任何异常表现。剖检死亡小鼠，发现其肺泡充血严重，肝脏、肾脏和脾脏有不同大小的病灶，无菌采集死亡小鼠内脏涂擦于TSA平板上，37℃过夜培养，于心、肝、脾、肺、肾中分离到与LXY019株菌落形态大小一致的细菌菌落(图5)。

根据公式LD50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]，计算得到分离菌LXY019株对小鼠的半数致死量为1.58×10⁷ CFU/mL。

A、C.攻毒死亡小鼠内脏分离菌菌落形态及革兰氏染色结果(×100)；B、D. LXY019株菌落形态及革兰氏染色结果(×100)；E、F.攻毒死亡小鼠及健康小鼠内脏形态(依次为心、肝、脾、肺、肾)

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