驴源马链球菌马亚种LXY019株的分离鉴定、生长曲线、致病性及耐药性分析（三）
2.6 分离菌LXY019株毒力基因检测
对驴源分离菌LXY019株进行相关毒力基因检测，5种毒力基因鉴定结果显示，LXY019株携带fneB和seM毒力基因(表3)。
表3 毒力基因检测结果
| 毒力基因 Virulence gene | 结果 Result |
|---|---|
| fneB | + |
| seM | + |
| hylB | — |
| lytA | — |
| ply | — |
注：“+”表示基因被检出；“—”表示基因未检出。
2.7 分离菌LXY019株药物敏感性检测
根据抑菌圈大小(表4)，确定驴源分离菌LXY019株对氨苄西林、头孢噻肟、克拉霉素、红霉素、庆大霉素、阿米卡星、四环素、环丙沙星8种药物高度敏感；SEE-M对氨苄西林、头孢噻肟、克拉霉素、红霉素、庆大霉素、环丙沙星6种药物高度敏感，对四环素中介敏感，对阿米卡星存在耐药性；标准菌ATCC9528对氨苄西林、头孢噻肟、克拉霉素、红霉素、庆大霉素、阿米卡星、四环素、环丙沙星7种药物高度敏感。
表4 3株菌药物敏感性试验结果(x±s, n=3)
| 药物 Drug |
菌株 Bacterial strain |
判定标准 Judgment criteria |
抑菌圈直径/mm Inhibition zone diameter |
敏感程度 Sensitivity level |
||
|---|---|---|---|---|---|---|
| R | I | S | ||||
|
氨苄西林 Ampicillin |
LXY019 | — | — | ≥24.0 | 53.2±0.6 | S |
| SEE-M | — | — | ≥24.0 | 40.2±0.7 | S | |
| ATCC9528 | — | — | ≥24.0 | 35.3±0.6 | S | |
|
头孢噻肟 Cefotaxime |
LXY019 | — | — | ≥24.0 | 54.1±1.9 | S |
| SEE-M | — | — | ≥24.0 | 41.4±0.2 | S | |
| ATCC9528 | — | — | ≥24.0 | 39.1±0.6 | S | |
|
克拉霉素 Clarithromycin |
LXY019 | ≤16.0 | 17.0~20.0 | ≥21.0 | 53.2±1.0 | S |
| SEE-M | ≤16.0 | 17.0~20.0 | ≥21.0 | 42.5±0.8 | S | |
| ATCC9528 | ≤16.0 | 17.0~20.0 | ≥21.0 | 38.8±0.9 | S | |
|
阿米卡星 Amikacin |
LXY019 | ≤14.0 | 15.0~16.0 | ≥17.0 | 20.2±0.6 | S |
| SEE-M | ≤14.0 | 15.0~16.0 | ≥17.0 | 13.1±0.6 | R | |
| ATCC9528 | ≤14.0 | 15.0~16.0 | ≥17.0 | 20.9±0.5 | S | |
|
庆大霉素 Gentamicin |
LXY019 | ≤12.0 | 13.0~14.0 | ≥15.0 | 23.3±1.5 | S |
| SEE-M | ≤12.0 | 13.0~14.0 | ≥15.0 | 20.1±1.7 | S | |
| ATCC9528 | ≤12.0 | 13.0~14.0 | ≥15.0 | 23.0±0.8 | S | |
|
四环素 Tetracycline |
LXY019 | ≤18.0 | 19.0~22.0 | ≥23.0 | 34.3±0.1 | S |
| SEE-M | ≤18.0 | 19.0~22.0 | ≥23.0 | 18.9±0.4 | I | |
| ATCC9528 | ≤18.0 | 19.0~22.0 | ≥23.0 | 23.5±1.1 | S | |
|
环丙沙星 Ciprofloxacin |
LXY019 | ≤15.0 | 16.0~20.0 | ≥21.0 | 31.4±1.9 | S |
| SEE-M | ≤15.0 | 16.0~20.0 | ≥21.0 | 24.0±0.5 | S | |
| ATCC9528 | ≤15.0 | 16.0~20.0 | ≥21.0 | 20.9±0.5 | I | |
|
红霉素 Erythromycin |
LXY019 | ≤15.0 | 16.0~20.0 | ≥21.0 | 56.9±1.2 | S |
| SEE-M | ≤15.0 | 16.0~20.0 | ≥21.0 | 42.6±0.7 | S | |
| ATCC9528 | ≤15.0 | 16.0~20.0 | ≥21.0 | 36.5±1.0 | S | |
注：S. 敏感；I. 中介；R. 耐药。
3 讨论
中国是世界主要产驴国之一，养殖历史悠久，随着养驴业的发展，新疆驴存栏量持续增长，已高达126.06万头，自2018年山东省驴场暴发腺疫以来，中国关于腺疫的报道愈发频繁，新疆驴产业也受到影响，存栏量降到前所未有的低谷(14.77万头)。Waller研究认为，处在感染马链球菌马亚种表现症状前的马属动物传播腺疫的概率远远高于患病动物通过化脓性分泌物传播的概率，驴源引进是导致腺疫感染的主要途径，由于个体差异问题，一些抵抗力较高的病原携带者或者处于潜伏期的感染者，通过症状表现不能判断是否被感染，而驴流通范围的扩大，将增加感染腺疫的几率，给驴产业造成巨大的经济损失。
从新疆喀什泽普县某驴场患病驴病料中分离获得透明针尖大小、有β溶血环的菌株，革兰氏染色呈蓝色短链状，符合马链球菌马亚种形态特征，分离菌株16S rDNA测序比对确定，该驴场驴群为马链球菌马亚种感染所致的腺疫，遗传进化分析发现病原分离菌LXY019与2021年新疆马链球菌马亚种分离菌HTP133遗传距离最近。相关研究表明，HTP133株与美国马链球菌马亚种(Streptococcus equi subsp. equi strain, ATCC33398)同源性较高。历史记载中国家驴主要产自非洲，经由西亚和东亚，传至中国新疆。从1995年起至今，新疆先后引进了新吉尔吉斯马、英纯血马、美国速步马等，这可能是分离株LXY019与英国马链球菌马亚种同源性高的原因。
fneB、seM、hylB、lytA和ply是马链球菌马亚种常见的毒力基因，其编码的蛋白分别为纤黏蛋白结合蛋白、类M蛋白、透明质酸裂解酶、链球菌自溶素、链球菌溶血素，其中纤黏蛋白结合蛋白可与机体内的纤黏蛋白结合，助力病原菌在机体内侵袭扩散；类M蛋白能够与纤维蛋白原和免疫球蛋白结合，抑制吞噬作用，达到感染动物机体的目的；透明质酸裂解酶在马链球菌马亚种进入集体后，降解透明质酸，使病原菌迅速渗入组织，顺利达到侵袭目的；链球菌自溶素可使菌体发生自溶，导致胞内多种毒素(如链球菌溶血素等)释放以危害宿主，同时还可干扰机体的免疫系统，协助病原菌逃避免疫；链球菌溶血素是一种胞内蛋白，属于胆固醇结合毒素，与宿主细胞表面的胆固醇结合后使细胞溶解，对宿主危害极大。根据对驴源马链球菌马亚种分离菌的5种相关毒力基因检测结果，发现驴源分离菌LXY019株携带有两种毒力基因(fneB和seM基因)，孙丹岚等对马链球菌进行7种毒力基因鉴定，其中三种毒力基因被表达，携带fneB基因的分离株最多，其次为lytA和ply，结合小鼠致病性试验结果(分离菌LXY019株对小鼠的半数致死量LD50=1.58×10⁷ CFU/mL)，推测驴源分离菌LXY019株依靠类M蛋白在机体内抵抗吞噬，通过纤黏蛋白结合蛋白达到侵袭扩散作用，当进入机体的细菌达到一定量时，将会导致动物机体产生病理反应，甚至死亡。
根据3株马链球菌马亚种药物敏感性结果，驴源分离菌LXY019株对抗生素的敏感性普遍高于其他两株保存菌株，3株菌均对β-内酰胺类抗生素(氨苄西林、头孢噻肟)和大环内酯类抗生素(克拉霉素、红霉素)敏感，而对四环素和氨基苷类抗生素(阿米卡星、庆大霉素)的敏感性相对较低。黄荣等研究表明，青海驴腺疫分离菌对β-内酰胺类抗生素高度敏感；王宁等研究发现，驴腺疫分离菌对β-内酰胺类抗生素(头孢曲松、苯唑西林)、大环内酯类抗生素(红霉素)和人工合成类抗生素(利福平)敏感；多种研究均表明，马腺疫链球菌对青霉素等抗生素敏感。由此可见，在治疗该马链球菌马亚种引起的腺疫时，可选用β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素进行有效治疗。
4 结论
综上所述，本研究分离的驴源马链球菌马亚种LXY019株与2021年新疆马链球菌马亚种分离菌HTP133遗传距离相近，携带fneB和seM基因，对小鼠有一定的致病性，临床治疗推荐选用β-内酰胺类抗生素和大环内酯类抗生素。研究结果可以为驴源马链球菌马亚种感染的驴腺疫防治及其新药研发提供参考。