青贮乳酸菌生长曲线、产酸和抑菌能力、抗生素耐药性测定（一）
摘要: 目的 从青贮巨菌草中筛选分离抑菌性能良好的乳酸菌，并研究其对蚕豆秸秆青贮发酵的效果。方法 从青贮巨菌草中分离纯化乳酸菌；用指示菌(大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)筛选获得拮抗菌；综合菌落形态、革兰氏染色和16S rDNA分析对其进行鉴定；通过生长曲线、产酸和抑菌能力、抗生素耐药性等确定青贮乳酸菌的特性；用筛选到的具有较强抑菌能力的乳酸菌发酵蚕豆秸秆，检测蚕豆秸秆的常规营养成分，并进行感官评价和霉菌毒素含量测定，确定所筛选乳酸菌对青贮发酵的效果。结果 从巨菌草青贮产物中筛选到1株可抑制大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的乳酸菌R-01，并将其鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌生长优良，产酸性能好，有较强的抑菌能力；对多种抗生素有较强的耐药性；将该菌作为添加剂，能有效提高青贮蚕豆秸秆的营养价值并降低霉菌毒素含量。结论 筛选鉴定的R-01乳酸杆菌具有优良的生长、产酸、抑菌及耐药特性，可使青贮饲料快速酸化，能有效保持饲料营养成分，降低霉菌毒素含量并提升青贮整体效果，可作为青贮发酵菌株使用。
青贮涉及复杂的微生物相互作用，其中乳酸菌在青贮过程中发挥重要作用，它能酸化牧草并限制和破坏微生物(如霉菌和细菌)的生长，可最大限度保存饲料营养成分。在众多微生物添加剂中，乳酸菌添加剂由于其高效生产代谢物的能力及廉价、环保的特点，被认为是动物饲料生产的天然添加剂，广泛应用于牧草发酵。添加乳酸菌的青贮饲料不仅乳酸含量高于传统发酵的青贮饲料，还可有效提高饲料的干物质回收率。此外，青贮乳酸杆菌能产生3-羟基癸酸，抑制毕赤酵母、烟曲霉和娄地青霉的生长，可抑制青贮饲料和反刍动物瘤胃中的有害微生物，从而提高动物的健康性能。但由于青贮发酵过程中产生的微生物群体较为复杂，同一种微生物添加剂在不同地区、原料和气候的影响下对实际生产的效果不同，因此根据具体情况从生产当地分离和筛选优质乳酸菌用于实践对提高青贮品质具有重大现实意义。
青贮饲料具有原料来源广的特点，因地制宜地选择青贮饲料原料是降低饲料成本的有效方式。秸秆是成熟农作物茎叶(穗)部分的总称，中国每年秸秆总产量超过7亿t，大部分被就地焚烧。蚕豆秸秆具有较高的营养和饲喂价值，但目前有关蚕豆秸秆青贮料及其乳酸菌添加剂处理的研究较少。因此，本研究从巨菌草青贮中分离鉴定具有较强抗菌性能的乳酸菌，并研究其菌株特性，使用优势乳酸菌进行发酵试验，以期为蚕豆秸秆的发酵利用提供理论指导。
1. 材料与方法
1.1 材料
巨菌草青贮产物来自云南省畜牧兽医科学院。MRS培养基购自青岛海博生物公司，革兰氏染色试剂盒购自北京兰杰柯公司；药敏片购自杭州滨和公司；ELISA试剂盒购自上海酶联生物公司。
1.2 方法
1.2.1 乳酸菌的分离纯化与保存
取青贮样品5 g与MRS培养液100 mL混匀，菌液接种至MRS培养基，挑选单菌落接种培养，反复挑斑、划板，直至在平板上形成单一纯菌株，编号后贮存于4 ℃冰箱备用。
1.2.2 乳酸菌的鉴定
菌液接种至MRS培养基培养后，再接种到相应液体培养液中培养，之后进行革兰氏染色。待测菌接种到MRS培养液30 ℃培养24 h，提取总DNA，采用细菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R (5′-TAGGGTTACC-TTGTTACGACTT-3′)进行PCR，产物送至昆明擎科有限公司测序。
1.2.3 生长曲线和产酸特性的测定
将活化后的R-01菌种按1:1000 (体积比) 接种于MRS液体培养基中，混匀后分装。使用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统进行培养与实时监测：将接种后的培养液加入系统的专用无菌检测板，置于系统30°C恒温培养单元中。系统通过高灵敏度传感器连续监测微生物代谢（如呼吸作用）导致的信号变化，自动记录并生成0-24小时内的实时生长动态曲线。为同步测定产酸特性，在上述培养过程中，每隔2小时额外无菌取样，使用pH计测定培养液的pH值。根据系统生成的生长曲线与手动测定的pH值，分别绘制菌株的生长动态曲线与产酸曲线。
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