响应面法优化显著提升鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01活菌数及其安全特性
摘要:对课题组前期分离得到的对模拟胃肠道耐受良好的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01(Lactobacillus rhamnosusZB1107-01)的培养基进行优化，初步研究了其益生特性，以提高单位体积发酵液中的菌体数量，为此菌株的开发和应用提供基础。首先，测定LR-ZB1107-01菌株在MRS培养基中的生长曲线，明确其在液体培养基中的生长规律;其次，以LR-ZB1107-01菌株发酵液中的活菌数为检测指标，对不同种类的氮源、碳源及生长因子进行单因素考察，以确定最适培养基组分，并进行响应面试验来优化培养基配比，以筛选最优发酵培养基;最后，对LR-ZB1107-01的硝基还原酶活性、氨基脱羧酶活性等体外安全性进行评价。结果表明，在2%葡萄糖含量的MRS培养基基础上，改变3种显著影响活菌数的营养成分及含量，即添加0.02%D-异抗坏血酸、0.12%硫酸镁、3%蛋白胨，再结合优化后的培养条件，活菌数可达8.56x10°CFU/mL，较在MRS培养基中提高了约10.7倍。体外安全性评价结果表明，LR-ZB1107-01对硝基还原酶和氨基酸脱羧酶均呈阴性，说明该菌株具有一定的安全性。文中研究成果对LR-ZB1107-01菌株微生态制剂的工业化生产和后续产品开发具有一定的指导作用。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是目前研究最深入和应用最广泛的益生菌之一，被广泛应用在乳制品、食品添加剂等领域。高纯度的鼠李糖乳杆菌对过敏体质有良好的缓解作用，在医药领域也有广泛的应用和研究价值。试验结果表明，鼠李糖乳杆菌在肠内长久定殖和生存，能够有效预防由细胞因子所引起的胃肠道疾病，不会对人体产生不良反应和副作用。此外，鼠李糖乳杆菌还具有一些自身的优势，比如，耐胆汁、耐胃酸并且可寄存于机体的肠内，终极产品(如鲜奶)保质期内的活菌数可以维持在一定范围内等，其在调节肠道功能、降低胆固醇、增强免疫力、预防儿童营养不良、预防和治疗结直肠癌、缓解抑郁焦虑情绪等方面都表现出良好的益生性能。因此，鼠李糖乳杆菌相关产品的种类不断增多，其功效也备受关注。
益生菌发挥其益生性能的前提是定殖在人体肠道内，很多研究强调定殖在肠道内的益生菌需达到一定数目才能发挥益生菌的功效，所以，新开发的益生菌资源投入商业应用的首要条件是提高菌体密度。文中从1月龄婴儿粪便中筛选得到了一株性能良好的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01，为将该菌株进行商业化使用，丰富我国本土益生菌资源，需要对该菌株进行安全性评价，并探索该菌株与肠道菌群的相互作用等。文中针对该菌株的增殖培养基进行优化，同时对其体外安全性做了初步探究，以期为开发益生菌制剂及其相关产品提供菌株资源。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1菌种和细胞
鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01，由笔者所在课题组从婴儿粪便中筛选获得，于2019年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.5172。大肠杆菌ATCC25922由华南理工大学食品科学与工程实验室提供。
1.1.2材料与试剂
MRS肉汤培养基、PCA培养基，广东环凯生物有限公司生产;氯化钠，分析纯，上海润捷化学试剂有限公司生产;蔗糖、氢氧化钠、盐酸，分析纯，广州化学试剂厂生产;无水葡萄糖，分析纯，天津市大茂化学试剂厂生产;琼脂粉、细菌学蛋白胨、酵母粉，广州环凯微生物科技有限公司生产;硫酸锰、维生素B1、叶酸，杭州麦克林试剂有限公司生产;硫酸镁、维生素C，天津致远化学试剂有限公司生产;硝酸盐培养基，广州环凯微生物科技有限公司生产;KI，阿拉丁试剂有限公司生产。
BASM培养基的制备:胰蛋白胨5.0g/L、酵母膏5.0g/L、牛肉膏5.0g/L、氯化钠2.5g/L、葡萄糖0.5g/L、吐温-80 1g/L、碳酸钙 1g/L、硫酸亚铁0.04g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.2g/L、柠檬酸铵5.0g/L、硫胺素0.01g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、5-磷酸吡哆醇0.05g/L、溴甲酚紫0.06g/L、琼脂20g/L，加蒸馏水1000mL，调pH值为5.3后，于121℃下灭菌10min。稍冷却后分装，分别加入1%的精氨酸、鸟氨酸。
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