基于生长曲线的大肠杆菌与丁酸梭菌对IPEC-J2细胞线粒体功能影响研究（一）
摘要
旨在探讨大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）和丁酸梭菌（Clostridium butyricum，C. butyricum）及代谢物对猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）线粒体功能及相关代谢途径的影响，为调控肠道健康提供理论依据。本试验首先通过筛选确定将培养至3 h时处于对数生长期且活性最好的细菌悬液用于后续试验。然后用不同浓度的大肠杆菌、丁酸梭菌、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFAs）去处理IPEC-J2细胞，每组设置3个重复，分析细胞活力和细胞形态结构筛选出最佳的处理时间和浓度，测定三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、线粒体膜电位、抗氧化及线粒体功能相关基因表达。
结果显示：1）筛选出大肠杆菌和丁酸梭菌处理IPEC-J2细胞的浓度分别为108 CFU·mL-1和106 CFU·mL-1，处理时间为1 h，SCFAs和LPS处理时间为1 h；2）丙酸和大肠杆菌处理组显著提高了ROS含量（P<0.05）；丁酸梭菌和LPS显著降低了ROS含量（P<0.05）；3）丁酸梭菌显著上调了ACC1、NRF1、TFAM、HO-1、APAF-1、PIG3、p53的表达（P<0.05），大肠杆菌处理组下调了TFAM和CtyC的表达（P<0.05），上调了p53的表达（P<0.05），丙酸和乙酸处理对各基因表达均无显著性影响。以上结果表明，SCFAs促进了细胞代谢，大肠杆菌和LPS激活细胞凋亡和生物氧化应激过程，丁酸梭菌可以激活IPEC-J2细胞线粒体脂质代谢、抗氧化系统和细胞凋亡，为靶向线粒体的肠道微生态调控策略提供了新视角。
肠道微生物对宿主健康有重大影响，是代谢物、激素和神经介质的重要来源，这些物质直接参与肠道功能调节，间接调节肝、脑和肾等肠外器官的功能。多项研究表明，均衡的肠道菌群对健康至关重要，调节脂质的代谢、胆汁酸及神经调控，它可以通过SCFAs增强粘液产生和促进调节性T细胞分化。此外，肠道微生物的代谢物可以影响转录组、表观遗传标志和酶活性，调节宿主细胞中线粒体生物发生、代谢和氧化还原反应，例如肠道微生物调节线粒体AMPK活性和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活剂-1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）信号传导，以控制线粒体自噬、氧化应激及炎症。
大肠杆菌是健康肠道的共生微生物菌种之一，但有些是机会致病菌，可以引起疾病。在肖金龙等的研究中，致病性大肠杆菌可以通过其高致病性毒力岛（HPI）激活NLRP3/Caspase-1炎症小体通路，诱导IPEC-J2发生焦亡，造成细胞膜和炎症因子释放。丁酸梭菌是动物和人类肠道中存在的天然有益菌，能够产生丁酸，调节肠道pH，维护肠道健康环境，保护其免受致病菌侵害。除了分泌代谢物，丁酸梭菌菌体本身是与宿主细胞直接对话的“名片”，完整的菌体已被证明在塑造肠道抗炎环境方面具有强大的能力，例如，在结肠炎模型中，丁酸梭菌能够诱导产生抗炎细胞因子白介素-10（IL-10）的肠道巨噬细胞增多，而丁酸梭菌菌体表面物质对细胞的影响研究相对缺乏，因此本研究设计试验组将细胞培养基中加入丁酸梭菌悬液，旨在观察丁酸梭菌表面物质或代谢物成分是否也对IPEC-J2细胞产生影响。
肠道微生物会对宿主生理功能和代谢产生重大影响，例如，相对于SPF小鼠，GF小鼠结肠中NADH/NAD和ATP水平显著降低，这表明了其在调节宿主结肠代谢方面具有特别重要的作用。线粒体是哺乳动物细胞中能量（ATP）来源的工作站并且唯一具有微生物起源的细胞器，参与细胞多项生理功能（如控制细胞凋亡、调节细胞钙平衡及免疫系统等），对维持细胞正常生理功能起到了不可缺失的作用，且近年来许多研究认为线粒体是微生物调控宿主细胞的重要靶点。然而，共生微生物如何精细调控肠道线粒体生物学功能从而影响宿主肠道健康还有待深入研究，现有研究多集中于小鼠或人类细胞模型，且缺乏对微生物-线粒体互作的系统性解析。IPEC-J2是源自猪空肠上皮细胞的非转化连续性细胞系，可以在培养过程中自发分化，形成具有生理相关性的肠道屏障模型。
本研究拟结合IPEC-J2细胞模型和大肠杆菌、丁酸梭菌及其代谢物，探究猪肠道微生物代谢物（如丁酸、乙酸）和丁酸梭菌代谢物或菌体表面物质对线粒体细胞活性、形态结构、膜电位和ROS、ATP含量、抗氧化及线粒体功能相关基因表达的影响，以期为通过微生物干预改善猪肠道健康提供理论依据。此外，LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，常用于模拟细菌感染或炎症反应，它作为病原相关分子模式，与大肠杆菌的作用机制相似，增加LPS处理组，可揭示其与肠道菌群的协同作用机制。最后，猪与人类肠道的相似性使本研究的结果可能为人类代谢疾病提供跨物种参考。
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