茄子（Solanum melongena L.）为中国重要的蔬菜作物之一，其种植历史悠久，分布范围广。近年来，随着消费市场的转型及农业产业结构的调整，中国茄子的生产布局、栽培模式及产业特点等均发生了显著变化。中国是茄子生产大国与消费国，根据联合国粮农组织（FAO）的统计数据表明，中国占全球约41%的种植面积，贡献了超过60%的全球产量（2021年达1866.6万t），年产量稳定在5300万t以上。茄子已成为继白菜、番茄之后的第三大蔬菜作物，在满足人们日常饮食需求及增加农民收入方面发挥着至关重要的作用。然而，随着设施栽培面积的不断扩大，导致连作障碍加剧，使得茄子黄萎病（Verticillium wilt）的发生率逐年加剧。该病害在我国茄子主产区呈现出40%~100%的发病率，造成产量损失，严重时可导致绝产，已成为制约茄子产业可持续发展的关键因素之一。

茄子黄萎病菌[Verticillium dahliae Kleb.]属于轮枝孢属（Verticillium）真菌，我国主要致病菌为大丽轮枝菌（V. dahliae）和白轮枝孢（V. albo-atrum）。在土壤环境中，研究表明其流行成灾的根本原因是病原菌能够产生抗性极强的微菌核，可在土壤中存活多年，成为持续的初侵染源。此外，微菌核的数量与病害的发生程度显著相关，当达到临界阈值时，会导致病害大规模爆发。微菌核在萌发的生理分化上，其强致病力小种（Race）的分布与优势，是引致抗药性菌株和传播的关键因素。在致病与流行机制研究层面，现代分子生物学，特别是农杆菌介导的遗传转化（ATMT）与绿色荧光蛋白（GFP）标记技术的应用，实现了绿色荧光蛋白（GFP）等报告基因的稳定标记，使得转基因育种有了新手段。亦应用在活体植株中实时、可视化观察病原菌的侵染动态，极大地推动宿主病理学研究。该标记技术在多种农作物及多种病原物中已被成功建立，例如水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米棒杆菌（Mycobacterium avium）等。

农杆菌介导的遗传转化（ATMT）技术是GFP标记技术在研究大丽轮枝菌对拟南芥、棉花、向日葵、番茄等植物的侵染过程中大量应用。其中，在拟南芥中，GFP标记菌株的接种试验显示，分生孢子于接种后6 h即可附着于根系；2~3 h后完成初级侵染，9 d后进入管状生长。植株至11 d出现全株系统性枯萎症状。对棉花研究进一步揭示了次代孢子在侵染时所产生的显著症状。在感病品种中，孢子萌发后在根部菌丝上24 h即萌发，7 d后菌丝侵入维管组织；而在抗病品种中，感病子萌发至5 d，基部接种点菌丝生长明显滞后。感病子萌发至10 d，整体侵染进程较感病品种滞后3~5 d，茎部接种也明显偏低，表明抗性可能部分源于对早期侵染的物理生理屏障作用。向日葵中，接种24 h后孢子呈丝状穿透根表皮，5~7 d先后入侧根及主根皮层萌发，7 d菌丝扩展至根茎具有明显的时空梯度。对马铃薯的侵染动态观察发现，24 h孢子于根部，显示其菌丝扩展至根皮层的时间节点后进入块茎组织的维管束组织，21 d茎部维管束中出现大丽轮枝菌菌丝，并可横向向邻近侧根系统扩展至叶片并最终导致植株枯萎的过程持续约42~70 d。ATMT介导的大丽轮枝菌的高效遗传转化不仅精细解析了其寄主互作策略，也为抗病品种选育与靶向防控技术的开发提供了关键时空生物学依据。

茄子黄萎病是我国东北设施栽培区的毁灭性土传病害，发病严重时可导致绝产，但其致病机制迄今未明，极大地制约了抗病品种选育与高效防控策略的研发。为攻克此难题，功能基因组学研究势必先行。然而，针对该地区优势菌株的高效农杆菌介导的遗传转化体系尚未建立，缺乏可重复的标准化流程。其中一个转化体系的核心因素均不明朗；再者，外源基因的插入是否会改变病原菌自身的生物学特性，如生长速率、产孢能力或致病力等。为解决上述问题，该研究成功构建了基于农杆菌介导的茄子黄萎病菌高效遗传转化体系，并系统优化确立了最佳转化条件。利用该体系，成功获得了15株稳定表达绿色荧光蛋白的标记菌株。经分子鉴定与多代抗性验证，GFP基因已稳定整合并遗传；通过对它们的生长速率、产孢量、粗毒素分泌量及致病力的综合评估，证实这些标记菌株的核心生物学特性与野生型基本一致，为后续观察茄子黄萎病菌对茄子维管束侵染过程提供试验菌株，为研究茄子黄萎病致病机理、挖掘茄子黄萎病相关基因以及分离鉴定抗茄子黄萎病基因提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株、试剂及仪器

大丽轮枝菌EP-A菌株分离自黑龙江省茄子种植基地，保存于黑龙江省农业科学院园艺分院。含GFP基因、潮霉素B抗性基因质粒pKHT2、大肠杆菌（DH5α感受态细胞）购自江苏省农业科学院张保龙教授。农杆菌感受态（LBA4404）购自天根生化科技有限公司；潮霉素B、利福平购自Sigma公司，查氏Ⅰ号培养基（CDM）培养基配方参照张健；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar, PDA）、LB（Luria-Bertani）培养基、诱导培养基（Induction Medium, IM）及筛选培养基（selection medium, SM）配方参考严亚贤。

主要仪器：丹麦BioSense公司oCelloScope微生物生长监测系统（用于菌落生长动态连续监测及菌液OD₆₀₀等效BCA值测定）、紫外分光光度计（Backman，德国）、厌氧/恒温培养箱等。

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