基于生长曲线的大肠杆菌与丁酸梭菌对IPEC-J2细胞线粒体功能影响研究（二）
1 材料与方法
1.1 试验材料
主要仪器：CO2培养箱、厌氧工作站、光学显微镜、倒置荧光显微镜DMi8、NanoDrop2000、分光光度计、酶标仪、丹麦Biosense微生物生长动态监测系统等。
试剂材料：ATP检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、活性氧检测试剂盒、Cell Counting Kit-8（CC-K8）试剂盒、脂质氧化（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、Western及IP细胞裂解液、强化梭菌培养基（RCM）、改良吉姆萨染色液（20X）、PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA和LPS购自碧云天生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒购自广州美吉生物科技有限公司；乙酸、丁酸、丙酸购自生工生物工程股份有限公司；猪肠道上皮细胞IPEC-J2购自上海通派生物科技有限公司；大肠杆菌来源于重庆市畜牧科学院生物工程研究所自主保种菌，丁酸梭菌购买于北纳生物公司进行了一代测序的保种菌种，保藏编号为DSM10702=ATCC19398。
1.2 测定指标和方法
1.2.1 大肠杆菌生长曲线的测定
1）接种环挑取大肠杆菌在LB固体培养基上，经三区划线后，置于37 ℃恒温培养箱中培养，待长出菌落。2）用接种环挑取3~5个单个菌落于含有5 mL LB液体培养基的试管中，置于37 ℃恒温摇床中200 r·min⁻¹培养12 h，获得种子液。3）将种子液按1:20的比例接种于装有100 mL LB液体培养基的丹麦Biosense微生物生长动态监测系统专用反应瓶中，混匀。4）将反应瓶置于该系统37 ℃恒温测量位（设置振荡速度200 r·min⁻¹），在软件中设定以OD600 nm为检测指标，自动连续监测25 h，系统实时记录吸光度数据并绘制生长曲线。5）取1、2、3、4和6 h时的菌液进行涂板计数（与系统监测同步取样）。
1.2.2 丁酸梭菌生长曲线的测定
1）接种环挑取丁酸梭菌在RCM固体培养基上，经三区划线后，置于37 ℃恒温厌氧工作站中培养至菌落形成。2）用接种环挑取3~5个单个菌落置于含有5 mL RCM液体培养基的试管中，于37 ℃恒温厌氧工作站中静置培养12 h，获得种子液。3）在厌氧环境下，将种子液按1:20的比例接种于装有100 mL RCM液体培养基的丹麦Biosense微生物生长动态监测系统（配备厌氧模块）专用反应瓶中，混匀。4）将反应瓶置于该系统37 ℃恒温厌氧测量位，在软件中设定以OD600 nm为检测指标，自动连续监测25 h，系统实时记录吸光度数据并绘制生长曲线。5）取1、2、3、4和6 h时的菌液进行涂板计数（与系统监测同步于厌氧环境下取样）。
1.2.3 大肠杆菌和丁酸梭菌悬液制备
1）将大肠杆菌（丁酸梭菌）培养至对数生长期内；2）取出菌液，4 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，加入10 mL无菌PBS溶液洗涤3次；3）弃掉PBS后，加入DMEM基础培养基，吹打混匀，使用分光光度计在OD600 nm处测定吸光度，并配置不同浓度的菌悬液。
1.2.4 IPEC-J2细胞传代
猪肠道上皮细胞培养至达80%~90%汇合度即可传代培养，细胞传代3~4次后，收集细胞并进行细胞计数后用于试验。
1.2.5 细胞培养与处理
细胞接种：96孔板（细胞活性鉴定使用CCK-8）：100 μL 2.5×105个·mL-1 IPEC-J2细胞悬液。12孔板（细胞形态结构、线粒体膜电位）：1 mL 2.5×105·mL -1 IPEC-J2细胞悬液。24孔板（ATP、ROS、SOD、MDA、基因表达）：1 mL 2.5×105·mL-1 IPEC-J2细胞悬液。培养条件：37 ℃、5%、CO2培养12 h，显微镜下观察到90%细胞贴壁后，弃掉培养基，PBS清洗2~3次。
分组处理：对照组：100 μL DMEM（CCK-8）、1 mL DMEM（其余检测组）。处理组：CCK-8组分别为1×108 CFU·mL-1大肠杆菌、1×107 CFU·mL-1大肠杆菌、1×108 CFU·mL-1丁酸梭菌、1×107 CFU·mL-1丁酸梭菌、1×106 CFU·mL-1丁酸梭菌、10 μg·mL-1 LPS、5 mmol·L-1乙酸、1 mmol·L-1丙酸和0.5 mmol·L-1丁酸，处理时间为1、3、6、12、24、48 h，每组3个重复。
细胞形态结构组分分别为1×109 CFU·mL-1大肠杆菌、1×108 CFU·mL-1大肠杆菌、1×107 CFU·mL-1大肠杆菌、1×108 CFU·mL-1丁酸梭菌、1×107 CFU·mL-1丁酸梭菌和1×106 CFU·mL-1丁酸梭菌，每组3个重复，处理时间为1、2和3 h。
其余各检测指标组分别为1×108 CFU·mL-1大肠杆菌、1×106 CFU·mL-1丁酸梭菌、10 μg·mL-1 LPS、5 mmol·L-1乙酸、1 mmol·L-1丙酸和0.5 mmol·L-1丁酸。每组设3个重复，处理时间为1 h。
终止处理：弃掉处理液，PBS清洗1次。
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