生活饮用水中微生物检测方法、菌落总数和肠球菌菌数定量分析（二）
氯化钠(CAS: 7647-14-5，重庆川东化工有限公司生产)，胰蛋白胨大豆琼脂(tryptic soy agar, TSA)、营养琼脂(nutrient agar, NA)、哥伦比亚血琼脂平板(北京陆桥技术股份有限公司生产)，D-(+)-海藻糖二水合物(CAS: 6138-23-4，上海梯希爱化成工业发展有限公司生产)，Difco Skim Milk脱脂奶粉[碧迪医疗器械(上海)有限公司生产]，聚乙二醇6000(CAS: 25322-68-3，上海沪试实验室器材股份有限公司生产)，二甲基亚砜(细胞培养级)(CAS: 67-68-5，北京索莱宝科技有限公司生产)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司生产)，CATC琼脂、1% TTC溶液、胆汁七叶苷琼脂(bile esculin agar, BEA)培养基、脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth, BHIB)培养基、脑心浸萃琼脂(brain heart infusion agar, BHIA)培养基、革兰染色液(北京陆桥技术股份有限公司生产)。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株培养及鉴定
根据GB/T 5750.12-2023中菌落总数的定义，即在一定条件下，经一定时间培养后所得1 mL水样中微生物菌落总数。根据以往检测相关产品的经验发现此类实际样品中革兰阳性菌和革兰阴性菌都有检出，故选择其中常见且具有代表性的菌株作为本研究样品中的目标微生物，主要有蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌。将上述(即1.1步骤中)的标准菌株接种于TSA琼脂平板和哥伦比亚血琼脂平板，(36±1)℃条件下培养18~24 h，采用革兰染色镜检、全自动微生物鉴定及VITEK-2 Compact和MALDI-TOF对菌株进行鉴定。
1.3.2 样品制备
按照0.5%的脱脂奶粉和聚乙二醇6000、10%的海藻糖配制成冻干溶液备用；将1.3.1步骤中经确认的标准菌株复苏后传代1次，(36±1)℃培养18~24 h，刮取菌落，加入少量上述配好的冻干溶液制备成菌悬液。根据行业特点和产品的特殊性，革兰阳性菌(如芽胞菌)在实际样品里可培养的微生物中可能占有一定的相对优势，而革兰阴性菌相对较低，因此革兰阳性菌和革兰阴性菌按照4:1的比例进行添加，加入冻干溶液中采用磁力搅拌器对菌悬液进行充分混匀，均匀分装到无菌西林瓶中，盖上橡胶塞后放入冷冻干燥机进行低温真空冷冻干燥。冻干结束后盖好橡胶塞，再加盖一层铝塑盖，-18 ℃以下冷冻保存。冷冻干燥程序主要分为：冷冻阶段，主干燥阶段，二次干燥阶段。具体工艺参数：冷冻速度1 ℃/min，早期冷冻点-1 ℃ 15 min，冷阱温度-90 ℃，样品冷冻温度-52 ℃，加热温度25 ℃ 180 min。共制备400支样品并进行顺序编号，每支样品可同时检测菌落总数和肠球菌菌数两个项目。
1.3.3 样品均匀性
本研究共制备400支样品，按照GB/T 15000.3-2023《标准样品工作导则 第3部分：标准样品定值和均匀性与稳定性评估》的内容，采用办公软件Microsoft Office 365生成10个随机整数，从制备的样品批次中抽取相应编号的样品，每支样品重复检测2次。样品共计用220 mL无菌生理盐水进行再水化；样品恢复室温后无菌开启，立即加入5 mL无菌生理盐水，充分溶解后放入无菌瓶中，再用余下的无菌水清洗西林瓶内壁2~3次，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液为待测样品原液。使用oCelloScope微生物生长曲线分析系统对样品原液进行实时监测，通过分析微生物生长曲线特征参数（如最大生长速率、曲线下面积等）进行菌落总数和肠球菌菌数的快速定量分析。检测结果采用单因素方差分析法进行均匀性分析，采用IBM SPSS Statistics 27.0软件进行数据分析计算。若F小于自由度为(f1，f2)及给定显著性水平α (α=0.05)的临界值Fα(f1，f2)，则表明样品内和样品间无显著差异，样品是均匀的。
1.3.4 样品稳定性
按照GB/T 15000.3-2023《标准样品工作导则 第3部分：标准样品定值和均匀性与稳定性评估》的要求，对所制备的样品进行长期稳定性研究和短期稳定性(模拟运输稳定性)研究。稳定性检验的样品前处理及oCelloScope系统检测方法与均匀性研究相同，数据分析采用IBM SPSS Statistics 27.0软件进行。
1.3.4.1 短期稳定性
采用同步法进行样品短期稳定性的研究，样品采用-18 ℃条件下冷冻保存，即-18 ℃作为参考条件，模拟实际样品的运输条件，选择25、36、42 ℃共3个温度点，在25 ℃条件下样品取9支，分别在第1、5、7天时每天检测3支；36 ℃条件下样品9支，分别在第1、5、7天时每天检测3支；42 ℃条件下样品9支，分别在第1、3、5天时每天检测3支，每个样品重复测试2次。使用oCelloScope系统进行检测，检测结果与均匀性研究相同，均采用单因素方差分析法进行分析，若F < F临界，则说明结果无显著差异，样品在上述条件下运输是稳定的。
1.3.4.2 长期稳定性
长期稳定性研究采用经典法研究。样品在-18 ℃以下冷冻保存，依次在1个月、3个月、6个月、9个月、12个月共5个时间点，随机抽取3支样品进行检测，每个样品重复检测2次。检测结果基于oCelloScope系统获得的生长曲线数据，采用直线经验模型的趋势分析法进行评估，若|b1| < t(0.05, n-2) × s(b1)，则表明斜率不显著，未观察到不稳定性，式中：|b1|为均值斜率的绝对值，t(0.05, n-2)为t检验双边临界值，s(b1)为与斜率相关的不确定度。
1.3.5 样品定值
本标准样品依据GB/T 15000.3-2023的内容，采用多家具备oCelloScope系统操作能力及GB/T 5750.12-2023检测能力的实验室联合定值的方式，依据oCelloScope系统标准操作程序及GB/T 5750.12-2023中平皿计数法和滤膜法分别检测样品的菌落总数和肠球菌菌数，每个样品重复检测2次，邀请6家实验室参加。反馈的定值数据采用IBM SPSS Statistics 27.0软件进行数据分析计算，经异常值检验、正态性检验、等精度检验等统计分析，计算样品的标准值；评估不确定度的来源并对各不确定度来源进行分析、合成和扩展等处理计算得到相应不确定度。
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