食品微生物快检技术突破！基于IntuGrow的卡拉胶微菌落自动化计数新方法
本研究使用琼脂作为凝胶剂，而琼脂糖已在类似的基于图像的检测研究中应用。琼脂糖因其光学透明度优于琼脂的不透明外观而被用于成像。然而，在本研究以及另一项研究中，使用琼脂并未对获取高质量图像造成问题。使用较低（0.45% w/v）或较高（1.8% w/v）的琼脂浓度与PCA中标准琼脂浓度（0.9% w/v）相比，并未限制或改善卡拉胶对迷你琼脂平板外观和图像质量的吸湿效应。由于琼脂糖比琼脂更昂贵，且PCA是行业中常用的细菌计数培养基，因此没有改变培养基的动机，因为能够应用常用的标准琼脂将有助于IntuGrow或类似技术在食品工业中的实施。
IntuGrow不是第一个使用成像技术进行微生物计数的技术。这些技术的重要特征是扫描时间和扫描区域。测试版本的IntuGrow解决方案每孔扫描时间为五分钟（6孔板总共30分钟），通过拼接图像覆盖整个迷你琼脂平板区域（直径=25毫米）进行计数。使用完整视野（FOV）进行计数而不是部分视野是有益的，因为它增加了要分析的样品量并降低了检测限。先前研究使用了60毫米琼脂平板仅0.0014%的部分FOV，而另一项研究通过拼接图像覆盖了显微镜载玻片（11.6毫米×18.1毫米）上的完整样品。然而，另一项研究使用了比IntuGrow成像的迷你琼脂平板（直径=25毫米）大六倍的完整FOV（直径=60毫米琼脂平板），但他们的方法需要每30分钟手动切换两个琼脂平板进行成像，持续24小时。IntuGrow以65平方毫米/分钟的扫描速度进行成像，而另一项研究以2400平方毫米/分钟的扫描速度进行扫描，与另一项研究报告的较低速度17.7平方毫米/分钟形成对比。IntuGrow的自动扫描技术意味着每小时可以自动扫描六个迷你琼脂平板，这减少了平板的手动操作，从而降低了运营成本。
图5. 经IntuGrow处理后的卡拉胶样品基于图像的计数结果（D、E、F），原始图像（A、B、C）分别显示微生物污染程度分别为高、中、低的情况（从左至右）。图D、E、F中标明了检测到的菌落形成单位（CFU）数量及计算得出的 CFU /g浓度。
为了展示IntuGrow解决方案在具有挑战性的吸湿性食品样品（此处以卡拉胶为例）上的使用，测试了代表六种卡拉胶类型的14个不同样品，以模拟最坏情况。测试其他新方法的通常使用简单的单一或混合细菌培养悬浮液进行测试。然而，另一项研究也在长叶莴苣样品上测试了他们的光学成像检测方法。他们表明这是一种非挑战性食品，因为它很容易以3×的稀释倍数均质，并且报告食品样品对成像没有负面影响。相比之下，即使在标准100×稀释下，卡拉胶样品也会变成凝胶状，因此难以移液和与琼脂混合，从而对图像质量产生负面影响，如在使用中等（10×）到高（100×）稀释卡拉胶样品表面接种迷你琼脂平板的初步实验中观察到的那样，对应于500-5000 CFU/g的检测限。相反，当卡拉胶作为粉末分散在琼脂层表面上，然后在顶部添加琼脂层以创建"三明治"时，获得了更低的检测限（50 CFU/g）和更好的图像。另一项研究对生菜中的大肠杆菌获得了类似的1.7 log CFU/g（50 CFU/g）检测限。玻璃载玻片图像检测方法的检测限未由另一项研究报告。他们报告在一个样品中检测到低至155 CFU的数量，然而未与传统平板计数进行比较。
在这里，我们展示了将卡拉胶样品封装在"三明治"方案中，将水胶体的吸湿活动引起的背景噪声降低到IntuGrow DELAY算法可以处理噪声以实现微菌落检测和计数的水平。将这种三明治方案与选择性琼脂而不是PCA一起应用，如果光学清晰度允许检测典型菌落，该方法可能可用于吸湿性食品样品中的病原体计数。此外，未来的前景之一是利用人工智能的发展与基于显微镜的方法相结合，通过非选择性琼脂上微菌落生长的特征潜在地自动区分致病和非致病细菌。
3.3. 传统微生物分析与延时显微镜分析之间CFU计数的比较
图6A显示了传统平板计数和IntuGrow计数方法对14个不同卡拉胶样品从低到高污染水平获得的CFU/g结果。计数范围从样品A的10^4 CFU/g到样品C和D的10^2 CFU/g。通常，尽管存在图2所示的问题，两种方法之间仍有良好的一致性。IntuGrow略高的检测限（50 CFU/g）与传统平板计数的检测限（40 CFU/g）相比，分别导致六个和两个重复低于检测限。然而，在5%的样品中，传统平板计数由于蔓延或广泛的卡拉胶气泡形成而无法产生结果，而IntuGrow的延时图像使计数成为可能。Deming回归显示两种方法在所有样品之间存在显著相关性，拟合斜率为0.96±0.19，y轴截距为0.197±0.58。
图6. 14种卡拉胶样品的细胞浓度（log CFU /g）对比。实验同时检测了原始商业卡拉胶样品（A、B、C、D、E、F）以及通过稀释（/稀释倍数）或添加微生物(s)处理后获得的微生物浓度降低或升高的样品。所有样品均在独立实验中进行了两次重复测试。A）所有测试卡拉胶样品及其重复样本的细胞浓度；B）各卡拉胶类型平均细胞浓度的Demings回归曲线，图中配有完美相关线（x = y）用于直观对比；C）IntuGrow法与平板计数法测得的平均 CFU 浓度残差图。
两种方法之间的近乎完美相关性伴随着意外的偏差-0.33±0.36 log CFU/g，这意味着传统平板计数平均产生的计数比IntuGrow的计数高0.33 log CFU/g。使用传统平板计数的高估可能是由于错误地计数具有菌落形态的卡拉胶结构和气泡。IntuGrow的低估也可能是由粉末中的潜在抑制化合物（包括卡拉胶本身）引起的，这可能会影响微生物生长，导致迷你琼脂平板上的微菌落减少。据报道，卡拉胶中的寡糖在低于20毫克/毫升的浓度下抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌，这里值得注意的是卡拉胶浓度在IntuGrow迷你琼脂平板（17.4毫克/毫升）中高于传统平板计数方法（8.3毫克/毫升）。三明治方案与传统平板计数之间的差异也可能与样品制备有关，其中倾注平板稀释过程中使用的均质可能更有效地分散菌落。
虽然实施本文所述的基于图像的技术似乎有望对具有挑战性的吸湿性食品样品进行快速准确的计数，但需要验证和现场测试以确保执行计数方法的操作员之间的再现性。此外，当前每个oCelloScope微生物生长动态监测仪仅运行六个样品的容量限制可能会限制该技术对需要更高样品通量的公司的实用性。然而，这与仅12-20小时与标准方法72小时的结果时间相抵消。因此，更快的测试结果可以帮助将卡拉胶的产品放行率提高至少两天，而不会导致对微生物质量的危险失败预测。实施的一个重要障碍将是投资，这在很大程度上取决于公司的财务状况、实施新技术的意愿和估计的投资回报期。
4. 结论
总的来说，本研究的结果表明，光学延时显微镜有潜力用于快速评估具有挑战性食品样品中的微生物质量，将结果时间从72小时缩短至最早12小时。Deming回归显示IntuGrow的延时显微镜基于图像的计数与传统平板计数之间存在近乎完美的相关性。当前技术需要在工业环境中进行验证，以测试该方法操作员之间的再现性。IntuGrow对卡拉胶等具有挑战性的吸湿性食品样品中的细菌进行计数的能力意味着该技术应易于应用于易稀释样品或非水胶体粉末。延时显微镜基于图像的生长监测在学术上还具有研究食品中经常出现的应激细菌微生物生长的有趣前景。