卡利比克迈耶氏酵母的鉴定、生长特性及其对果蔬病原真菌的拮抗作用研究
摘要：该文从宁夏枸杞果实霉腐斑中分离得到一株能拮抗多种病原真菌的酵母lut-Y1菌株，研究该菌株的菌落形态、细胞形态、生长曲线特征及适宜的生长温度、pH值及盐耐受度，用平板对峙法观察该菌株对链格孢菌(Alternaria alternate)、小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)的拮抗效果，并分析该菌株发酵液对3种病原真菌的抑菌活性。结果表明，酵母lut-Y1菌株在PDA液体培养基上生长良好，能分泌红色素，并具有酵母菌的一般形态特征。根据形态、rDNA-ITS区测序比对和系统进化树分析将酵母lut-Y1菌株鉴定为卡利比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)。酵母lut-Y1菌株在PDA液体培养下，6~18 h后进入对数生长期，18~36 h为稳定生长期，其适宜的生长温度和pH值分别为30℃和6~7，最适生长NaCl浓度为0%~3%。酵母lut-Y1菌株菌落与3种霉菌菌落之间形成明显的抑菌带。该菌株发酵液浓度与3种病原真菌生长圈直径之间均呈极显著负相关(P<0.01)，根据拟合方程，发酵液浓度分别为42.04%、38.42%、37.03%时，可完全抑制链格孢菌、小孢壳二孢、细极链格孢菌生长。酵母lut-Y1菌株可作为一种有广谱抑菌效果的生物防治菌，应用于果蔬防腐。
果蔬病害由霉菌、细菌等病原微生物寄生引起，是导致果蔬产量下降及采后腐败的主要原因。链格孢菌(Alternaria alternate)是丝孢纲丝孢目链格孢属的一种果蔬致病菌，是导致樱桃、猕猴桃、梨、宁夏枸杞等果实采后腐烂的一种真菌，受其侵染后会严重影响果蔬的产量与品质。细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)是链格孢属的另一种果蔬致病菌，由其引起的库尔勒香梨黑斑病、甜瓜黑斑病、甘蔗叶萎病导致果蔬市场遭受重大损失。小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)属于半知菌亚门、球壳孢目、壳二孢属。壳二孢属真菌常引起鹰嘴豆壳二孢疫病、美国甜豆的豌豆球腔病，造成全球豆科类蔬菜产量下降，损失严重。
化学防霉腐剂能有效控制病原微生物感染，但是长期使用化学杀菌剂容易引起病原微生物产生抗药性。另外，生产上频繁使用或使用高浓度化学杀菌剂均会造成果蔬表面农药残留和环境污染，存在食品和环境安全风险。因此，发展无公害型生物杀菌剂用于抑制果蔬腐败成为解决问题最有效的途径之一。
近年来，一些对病原菌具有拮抗作用的酵母菌成为开发生物杀菌剂的重要资源菌。研究表明，季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)可在猕猴桃中迅速定殖，通过与病原菌进行营养和空间的竞争有效抑制猕猴桃软腐病。膜醭毕赤酵母(Pichia membranefaciens)可诱导桃提高防御相关酶活性，增强桃抗病性。拮抗酵母与一些化合物合用能提高抑菌效果。茉莉酸甲酯能提高M. guilliermondii抑制苹果青霉病的效果，低聚海藻糖与M. guilliermondii合用能更好地防治柑橘感染青霉(Penicillium italicum)，植酸能增强胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)防治苹果采后腐烂的效果。可见，拮抗酵母菌制剂可能是化学杀菌剂最好的替代品。
本文从甘肃省兰州市永登县枸杞生产合作社产的宁夏枸杞果实霉腐斑中分离得到一株酵母lut-Y1菌株(保藏号CGMCC NO.20462)，并对其形态、培养特征、抑菌活性进行研究，以期为卡里比克迈耶氏酵母应用于果蔬防腐保鲜方面提供理论依据，并为开发以卡里比克迈耶氏酵母为主要活性成分的微生态制剂、生物杀菌剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 供试菌株
酵母lut-Y1菌株: 分离自甘肃省兰州市永登县枸杞生产合作社产的枸杞果实霉腐斑; 链格孢菌(Alternaria alternate)、小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima): 保存于兰州理工大学生命科学与工程学院实验室。
1.1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基: 马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15~20 g，补水至1 L，pH自然，121 ℃灭菌20 min。
PDA液体培养基: 马铃薯200 g、葡萄糖20 g，补水至1 L，pH自然，121 ℃灭菌20 min。
1.1.3 试剂
琼脂(生物试剂): 天津市科密欧化学试剂有限公司; 葡萄糖(分析纯): 天津市光复科技发展有限公司; 氯化钠(分析纯): 广东光华科技股份有限公司; BGI D2000 Plus DNA Ladder (Marker): 北京六合华大基因科技有限公司。
1.2 仪器与设备
扫描电子显微镜(3400N型): 日本Hitach公司;oCelloScope微生物生长动态分析仪：丹麦Biosense公司； 人工气候培养箱(MGC-1000HP-2): 上海一恒科学仪器有限公司; 离心机(H/T16MM型): 湖南赫西仪器装备有限公司; 紫外可见分光光度计(L6物联智能): 上海佑科仪器仪表有限公司; 超净工作台(SW-CJ-1FD型): 苏州净化设备有限公司; 手提式压力蒸汽灭菌器(DSX-280B): 上海申安医疗器械厂; 电子分析天平(AB104-N型): 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司; 振荡培养箱(HNY-200B): 天津欧诺仪器股份有限公司; 恒温培养箱(DH4000BII): 天津市泰斯特仪器有限公司。
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