枸杞霉腐病拮抗酵母分离鉴定、生长曲线绘制与抑菌机理初探
1.3 方法
1.3.1 酵母lut-Y1菌株的分离纯化及鉴定
酵母lut-Y1菌株分离自发生霉腐的宁夏枸杞鲜果。选取具有典型霉腐斑的果实，在病健交界处剪取约5 mm x 5 mm的小块组织。先用2%的次氯酸钠溶液对组织块表面消毒5分钟，用无菌水清洗5遍，再用75%的酒精消毒30秒，最后用无菌水清洗8遍。将消毒后的组织块转移至无菌培养皿中，加入1 mL无菌水并捣碎。随后，用接种环蘸取含菌组织液，在PDA固体培养基平板上进行划线分离。将平板置于28℃培养箱中培养，待菌落长出后，根据形态特征挑取疑似酵母的单菌落。此纯化过程连续进行3次，以确保获得纯培养物。纯化后的菌株即为酵母lut-Y1，保存于PDA斜面培养基上，置于4℃冰箱备用。
酵母lut-Y1菌株菌落形态观察方法: 将酵母lut-Y1菌株划线培养至PDA固体培养基，30 ℃倒置培养2 d后观察菌落形态。挑取PDA固体培养基上的菌体粘在碳导胶样品台上，置于液氮中速冻后在扫描电镜下观察细胞形态。
酵母lut-Y1菌株分子鉴定方法: 将酵母lut-Y1菌株接种到PDA固体培养基上，30 ℃条件下培养2 d后送至宝生物工程(大连)有限公司进行菌株基因组DNA提取、聚合酶链式反应(PCR)扩增和内转录间隔区(ITS)区序列测序，将所得序列与GenBank核酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行比对，用MEGA7.0软件和Neighbor joining法进行系统发育分析和进化树构建，自展次数为1000。最终根据ITS区序列测序分析及形态学鉴定，鉴定该菌株，并将该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.20462。
1.3.2 酵母lut-Y1菌株的生长特性
1.3.2.1 生长曲线的绘制
将活化后的lut-Y1斜面菌株用无菌水制成菌悬液。取一定体积的菌悬液，以1%（体积分数）的接种量接种到含有50 mL PDA液体培养基的无菌培养瓶中。将接种后的培养瓶置于丹麦Biosense公司oCelloScope微生物生长曲线分析系统中，设定温度为30℃，进行连续培养40 h。系统会自动、实时监测并记录菌悬液在特定光学参数下的变化（如透光率或细胞密度相关信号），以此反映菌体生长情况。系统软件将根据监测数据自动绘制生长曲线。
1.3.2.2 最适温度的测定
将500 μL菌悬液接种于50 mL PDA液体培养基，分别在25、30、35 ℃温度条件下，160 r/min振荡培养24 h，用紫外可见分光光度计在波长600 nm处测定培养液的吸光度，吸光度越大，则菌体密度越大。
1.3.2.3 最适pH值的测定
分别用1 mol/L NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液调整PDA液体培养基的pH值，使其pH值分别为4、5、6、7、8、9。在不同pH值的50 mL PDA液体培养基中分别接种500 μL酵母lut-Y1菌株的菌悬液。将接种好的培养基分别置于30 ℃、160 r/min振荡培养24 h。在600 nm处测量吸光度，吸光度越大，则菌体密度越大。
1.3.2.4 耐盐性的测定
将500 μL酵母lut-Y1菌株的菌悬液分别接种到50 mL不同NaCl浓度(0%、0.5%、1.0%、3.0%、5.0%)的PDA液体培养基中，于30 ℃、160 r/min振荡培养24 h，在600 nm处测量吸光度，吸光度越大，则菌体密度越大，以不添加NaCl的PDA液体培养基为对照。
1.3.3 酵母lut-Y1菌株的拮抗作用测定
采用平板对峙法将酵母lut-Y1菌株与待试病原菌[链格孢菌(Alternaria alternate)、小孢壳二孢(Ascochyta leptospora)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)]划线接种在同一PDA固体培养基平板上，观察菌落生长状况。
1.3.4 酵母lut-Y1菌株发酵液抑菌效果的测定
发酵液的制备: 按1%(体积分数)的接种量将500 μL酵母lut-Y1菌株菌悬液接种到50 mL PDA液体培养基中，在30 ℃、160 r/min条件下振荡培养18 h后，将发酵液4000 r/min离心10 min，上清液即为酵母lut-Y1菌株发酵液。
待试病原菌菌饼的制作: 分别向待试病原菌(链格孢菌、小孢壳二孢、细极链格孢菌)斜面菌种中加入4 mL无菌水，充分振荡，制成菌悬液后，取1 mL涂布在PDA固体培养基平板中，在室温下培养5~7 d，至菌体长满平板，用无菌打孔器在平板中央取直径为1 cm的待试病原菌菌饼。
酵母lut-Y1菌株发酵液对待试病原菌抑制效果的测定: 按表1配制梯度浓度发酵液-PDA固体培养基，灭菌后分装在直径9 cm的培养皿中，每皿25 mL。在发酵液-PDA固体培养基平板中央放置待试病原菌菌饼，置于30 ℃的恒温培养箱分别培养5~7 d，观察菌落形态，并测量待试病原菌的生长圈直径。用SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析待试菌的生长圈直径变化。
表1 酵母lut-Y1菌株发酵液-PDA固体培养基的配制
| 组别 | 发酵液体积/mL | PDA固体培养基/mL |
|---|---|---|
| 处理组 10% | 10 | 90 |
| 处理组 20% | 20 | 80 |
| 处理组 30% | 30 | 70 |
| 处理组 40% | 40 | 60 |
| 对照组 | 0 | 100 |
1.4 数据处理与统计分析
试验均设5次重复，采用SPSS 26.0软件分析数据，结果以平均值±标准差表示。单因素方差分析比较多组间均数，组间两两比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
相关新闻推荐
1、双歧杆菌分离鉴定、耐受性试验、益生特性试验及安全性评价（一）
3、水产养殖迟钝爱德华氏菌生长曲线及对链霉素敏感性检测（二）