基于可培养技术的古象牙病害微生物分离鉴定与抑菌剂筛选评价（二）
1.2.4抑菌实验
•抑菌剂的选择:为尽可能减少抑菌剂对古象牙文物本体的影响，选用以下抑菌剂分析其抑菌效果(表1)。
•细菌抑菌效果分析:采用杨盛智等关于最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定方法对抑菌剂的浓度进行筛选。采用二倍稀释法配置浓度分别为20 480、10 240、5 120、2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 mg/L的抑菌剂母液备用。按照1:9的比例将各浓度母液分别加入灭菌且降温至50°C的MHA培养基中，即稀释10倍，使得培养基中抑菌剂浓度分别为2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L。采用oCelloScope 微生物生长曲线测量仪将浊度为0.5麦氏比浊的供试菌，接种到含有不同浓度抑菌剂的MHA表面，每组3个重复，接种后的平板置35°C恒温培养24 h后，观察培养皿上供试菌株生长的情况，以0 mg/L抑菌剂琼脂平板为参照，判断抑制细菌生长的最低浓度，确定最小抑菌浓度。
•真菌抑菌效果分析:参考细菌MIC的测定方法，对抑制象牙表面真菌生长的抑菌剂进行筛选。同样采用二倍稀释法配置不同浓度的抑菌剂母液，制备含有400、200、100、50 mg/L浓度的制霉菌素、三氯生抑菌剂的PDA平板；苯扎氯铵制备抑菌浓度梯度为8000、4000、2000、1000 mg/L；苯并咪唑制备抑菌浓度梯度为2000、1000 mg/L。将直径为6 mm的真菌菌饼接种于含有不同浓度抑菌剂的PDA培养皿中，每组3个重复，对照组为不含任何抑菌剂的普通PDA培养皿。将接种后的培养皿置于25°C恒温培养5 d。观察真菌生长状况，将抑制所有真菌生长的最低浓度作为最小抑菌浓度。
1.2.5复合抑菌剂构建及效果评估
为提高抑菌效果，以前期筛选出的各抑菌剂能够抑制所有细菌或真菌生长的最小抑菌浓度为基础，采用二倍稀释法稀释后再进行两两组合配置复配抑菌液，并评估复配抑菌剂的抑制效果，若复配液能达到完全抑菌效果，进一步通过二倍稀释法再次降低各抑菌剂的复配浓度，直至筛选出各复配抑菌剂能够抑制所有真菌或细菌生长的最小复配浓度。
1.2.6数据分析
统计学分析使用SPSS20.0软件处理。
2结果与分析
2.1古象牙残片表面微生物观察
采用超景深显微镜对古象牙残片样品表面微生物进行检测，结果显示样品XY51-1和XY51-2表面主要生长着白色如棉絮状的菌丝，具有典型的霉菌特征；样品XY52-1表面产生了大量类似于细菌生物膜的红色黏性物质，无明显菌丝结构。
2.2古象牙表面可培养微生物分离及形态观察
针对不同古象牙残片表面微生物生长情况，采用TSA分离古象牙残片XY52-1表面附着的微生物，采用PDA培养基分离古象牙残片XY51-1和XY51-2表面絮状微生物。如图3所示，从不同古象牙残片表面分离出菌落形态存在明显差异的菌株，表明导致残片表面形成的病害现象是由不同微生物共同作用的结果。
从古象牙残片表面共分离获得33株菌，其中有4株菌在TSA培养基上呈现出乳白色、淡黄色、橘红色的菌落颜色，菌落大小不一，表面湿润光滑、边缘整齐等典型细菌菌落特征(图4)。菌株B6菌落较小，表面光滑，边缘整齐，菌落颜色呈橘红色，易挑取，革兰氏染色阳性，短杆状，无芽孢，菌体大小为0.5μm x 0.9μm；菌株B12菌落较小、呈圆形凸状，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈黄色，易挑取，革兰氏染色阳性，短杆状，无芽孢，菌体大小为0.6μm x 1.0μm；菌株B13菌落中间向内凹陷，表面光滑，边缘整齐，易挑取，菌落颜色呈乳白色，革兰氏染色阴性，菌体为杆状，菌体大小为1μm x 2μm，菌体光滑无鞭毛；菌株B106号菌落较小，表面光滑，边缘整齐，易挑取，菌落颜色呈乳白色，革兰氏染色阴性，短杆状，菌体大小1.3μm x 1.5μm。
29株菌菌落主要为褐色、白色、青灰色、红色等，菌落大小不一，疏松或紧密，呈絮状、绒毛状、短发状等典型真菌的菌落形态，显微形态观察表明，真菌菌体主要为菌丝分支形成网状结构或产生分生孢子(图4)。分离菌株中A21单菌落为白色棉絮状菌丝，与象牙表面的白色霉变物相似，显微观察可见分生孢子，孢子聚集呈手指状，菌丝有隔；分离菌株中A4单菌落表面干燥呈现绒状，菌落由内向外为黄色、白色、红色放射性生长，菌落扁平，菌落底部能分泌红色物质，将其染色后置于显微镜下观察可见分生孢子聚集呈链状，菌丝有隔。
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