一株枸杞源抗真菌酵母的生长动力学及其发酵液抑菌活性分析
2 结果与分析
2.1 酵母lut-Y1菌株的形态及鉴定
酵母lut-Y1菌株的形态特征、酵母lut-Y1菌株rDNA-ITS PCR扩增结果及系统进化树见图1~图3。
由图1可知，酵母lut-Y1菌株在PDA固体培养基上菌落呈圆形、边缘齐整、大且厚、中间隆起、不透明、光滑湿润、易被挑起，并分泌红色素，细胞形态为椭圆形，具有酵母菌的大小及形态特征。由图2可知，rDNA-ITS区测序得到该菌株552 bp的序列，与GenBank中的卡里比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica) CBS9966菌株(登录号: NR149348.1)的序列相似度达98.73%。由图3可知，酵母lut-Y1菌株与Meyerozyma caribbica(NR149348.1)菌株同源性达93%。根据上述形态和分子生物学特征，将酵母lut-Y1菌株鉴定为卡里比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)。
2.2 酵母lut-Y1菌株的生长特性
2.2.1 酵母lut-Y1菌株生长曲线
酵母lut-Y1菌株生长曲线见图4。
由图4可知，酵母lut-Y1菌株在PDA液体培养条件下，迟滞期约6 h，6~18 h为对数生长期，18~36 h为稳定生长期，36 h后进入衰亡期。
2.2.2 不同温度对酵母lut-Y1菌株生长的影响
温度影响酵母菌活性和对营养物质的吸收利用，是酵母菌生长的关键因素，不同酵母菌最适生长温度存在差异。图5为温度对酵母lut-Y1菌株生长的影响。
由图5可知，在PDA液体培养基中，酵母lut-Y1菌株吸光度随温度的升高呈现先增加后降低趋势。表明酵母lut-Y1菌株最适温度为30 ℃，这与管庆林等从番茄发酵液中分离得到的库得毕赤酵母的最佳生长温度相似。
2.2.3 不同pH值对酵母lut-Y1菌株生长的影响
pH值是影响酵母生长代谢及代谢产物的因素之一，pH值对酵母lut-Y1菌株生长的影响见图6。
由图6可知，当培养基pH值低于6时，吸光度随着pH值的升高而显著增加; 当pH值高于7时，吸光度随着pH值的升高而显著下降，表明酵母lut-Y1菌株在pH值为4~9的环境下均能生长，最适生长pH值为6~7。曹国琼等研究发现汉逊德巴利酵母的最适pH值为6.0，这与本试验结果相似。
2.2.4 不同NaCl浓度对酵母lut-Y1菌株生长的影响
NaCl浓度对酵母lut-Y1菌株生长的影响见图7。
由图7可知，NaCl浓度为0%~3.0%时，酵母lut-Y1菌株生长良好，当PDA液体培养基NaCl浓度为5.0%时，吸光度显著降低(P<0.05)，菌体生长受到抑制，但其吸光度仍大于1，表明酵母lut-Y1菌株仍能缓慢生长，具有较强的耐盐性能。这与张秋会等的研究结果相似，因此，酵母lut-Y1菌株有望成为耐高盐浓度、环境适应性强的菌株资源。
2.3 酵母lut-Y1菌株的拮抗作用
酵母菌抑制病原真菌感染的机理主要有干扰病原菌吸收营养、分泌水解酶破坏菌丝生长、诱导果蔬提高抗病性等方式。尼泊尔德巴利酵母(Debaryomyces nepalensis)能形成生物膜并在芒果表面黏附、定殖，同时分泌几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶降解菌丝，抑制芒果胶孢炭疽菌感染。罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)能通过诱导樱桃番茄中防御相关基因表达量上调、激发防御相关酶活性的方式提高抗病性。季也蒙毕赤酵母通过促进防御相关酶活性并上调相关基因表达量、抑制菌丝生长和孢子萌发的方式提高苹果果实对葡萄座腔菌的抗性。酵母lut-Y1菌株对3种病原真菌的拮抗作用结果见图8。
由图8可知，酵母lut-Y1菌株菌落与链格孢菌、小孢壳二孢、细极链格孢菌的菌落之间形成明显的抑菌带，能阻止3种病原真菌菌丝的生长与蔓延，这与多数拮抗酵母的抗菌机理相似。
2.4 酵母lut-Y1菌株发酵液的抑菌效果
酵母lut-Y1菌株发酵液对3种霉菌的抑制效果见图9。
由图9可知，酵母lut-Y1菌株发酵液能抑制链格孢菌、小孢壳二孢、细极链格孢菌生长。
酵母lut-Y1菌株发酵液的抑菌效果分析见表2。
由表2可知，发酵液浓度与3种病原真菌生长圈直径之间均呈极显著负相关; 根据拟合方程，发酵液浓度分别为42.04%、38.42%、37.03%时，可使3种病原菌不生长，发酵液对3种病原菌的抑制效果为细极链格孢菌>小孢壳二孢>链格孢菌。郭俊花等研究了11种药食同源植物提取物对果蔬常见腐败菌的抑菌效果，发现葛根75%乙醇提取物在加药浓度3.13 mg/mL时，对链格孢菌的抑制率为26%，与10%酵母lut-Y1菌株发酵液对链格孢菌的抑菌效果(25%)相近，而同样提取方法和加药浓度下，花椒提取物对链格孢菌的抑制率为95%，与40%酵母lut-Y1菌株发酵液的抑菌效果(91%)相近。朱杰等研究发现从枸杞根际土壤中分离得到的萎缩芽孢杆菌可用于防治樱桃叶斑病，其发酵液对细极链格孢菌的抑制率为44.96%，低于10%酵母lut-Y1菌株发酵液的抑菌效果，其发酵液对链格孢菌的抑制率为57.28%，低于30%酵母lut-Y1菌株发酵液的抑菌效果。Rosier等研究表明枯草芽孢杆菌对壳二孢属真菌的抑制率为63%，低于20%酵母lut-Y1菌株发酵液的抑菌效果。可见，酵母lut-Y1菌株对3种病原菌均有较好的抑菌活性。
表2 酵母lut-Y1菌株发酵液的抑菌效果
| 项目 | 与发酵液浓度的相关性 | r(Pearson) | 拟合方程 (Y为生长圈直径) | R2 |
|---|---|---|---|---|
| 链格孢菌 | 负相关 | -0.964** | Y=-0.96x-0.018x2+82.19 | 0.943** |
| 小孢壳二孢 | 负相关 | -0.909** | Y=-4.478x+0.067x2+83.14 | 0.992** |
| 细极链格孢菌 | 负相关 | -0.763** | Y=-5.209x+0.091x2+78.104 | 0.861** |
注: 表示影响极显著(P<0.01)。
3 结论
本研究从宁夏枸杞果实霉腐斑中分离得到酵母lut-Y1菌株，经形态和分子生物学鉴定为卡里比克迈耶氏酵母(Meyerozyma caribbica)，酵母lut-Y1菌株与Meyerozyma caribbica (NR149348.1)菌株的同源性为93%。在PDA液体培养基中0~6 h为迟滞期，6~18 h为对数生长期，18~36 h为稳定生长期，36 h之后进入衰亡期。该菌株的最适生长温度为30 ℃，最适pH值为6~7，最适生长NaCl浓度为0%~3%，具有较强耐盐性。酵母lut-Y1菌株能抑制链格孢菌、小孢壳二孢、细极链格孢菌生长。因此，卡里比克迈耶氏酵母lut-Y1菌株可作为一种广谱抑菌剂的生产菌，将在果蔬病害及采后生物防治方面有广阔的应用前景。
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