延时显微成像技术替代传统平板计数，评估食品原料中的微生物质量
摘要
在食品工业中，获得结果的时间对于更快的产品放行、最小化召回、减轻微生物污染问题以及最终的食品安全至关重要。卡拉胶是从红海藻（红藻门）中提取的，由于其吸湿性，被用作各种食品和饮料中的凝胶剂、增稠剂、质地改良剂或稳定剂。目前，标准的行业平板计数方法需要在样品与熔融琼脂混合前对样品进行一百倍稀释，以评估企业对企业发货前卡拉胶样品中的微生物污染水平。然而，即使经过这种稀释，卡拉胶仍会膨胀、形成团块、堵塞移液器，并在琼脂平板上留下厚厚的凝胶结构、气泡和碎片，导致微生物计数具有挑战性且容易出现人为错误。
在此，我们首次报告了使用由自动化延时显微镜IntuGrow解决方案监测的迷你琼脂平板来评估这种具有挑战性的食品原料中的微生物质量。无需稀释食品样品，将卡拉胶粉末分散在两层平板计数琼脂之间，可在12-20小时内计数细菌，而传统平板计数需要72小时。为光学延时显微镜开发了DELAY算法，并将其添加到IntuGrow分析软件中，通过使用先前图像对背景进行归一化来抑制膨胀效应并增强对生长微生物菌落的检测。延时显微镜图像监测使得可以从传统平板计数由于细菌蔓延而无法获得结果的卡拉胶样品中获得结果。两种方法之间的比较显示出近乎完美的Deming斜率0.96，而观察到的偏差为-0.33 log CFU/g，表明IntuGrow计数低于传统平板计数。这可能是由于后者平板中卡拉胶伪影被计为菌落所致。IntuGrow对卡拉胶等具有挑战性的食品原料中的细菌进行计数的能力意味着该技术应易于应用于易稀释样品或非水胶体粉末。应在工业环境中由不同操作员进行进一步测试，以验证该方法的再现性。
1. 引言
微生物细胞的定量计数是食品工业中监测食品安全的常见做法。传统平板计数方法涉及在倾注或涂布平板前对食品样品进行稀释，然后经过数天的培养后确定菌落形成单位（CFU）的数量。
然而，这种常规分析耗时且费力。此外，计数容易受到主观性和人为错误的影响，即使是训练有素的操作员也是如此，特别是对于那些具有内源性颜色、颗粒或干扰菌落可识别性的性质的具有挑战性的样品，会导致不准确的结果。对于水胶体如卡拉胶、黄原胶和结冷胶，此类问题很常见。卡拉胶是从红海藻（红藻门）中提取的，由于其吸湿性，被用作各种食品中的凝胶剂、增稠剂、质地改良剂或稳定剂。其吸湿性在食品和饮料中是有益的，但在微生物分析中具有挑战性，因为其在稀释和琼脂中吸收水分会改变琼脂平板的外观，形成不均匀的表面，从而影响其可读性。
琼脂平板上CFU计数的细菌计数替代方法包括基于流式细胞术的检测、光密度测量、活菌实时定量聚合酶链反应（qPCR）和涉及成像技术的检测。然而，由于卡拉胶的吸湿性会导致上述异质性浑浊和结块，只有qPCR和基于成像的检测仍然是可行的选择。尽管此类方法已在科学研究中广泛应用，但由于需要使用复杂且昂贵的设备以及熟练人员，其在工业质量控制（QC）部门中的实施并不广泛。事实上，成功的实施将需要具有竞争力的价格点的用户友好型解决方案。
已开发出创新的成像技术，通过观察和检测单个菌落作为CFU计数的替代方法进行直接计数，例如玻璃载玻片上微生物培养装置和ePetri芯片上显微镜。然而，这些技术使用与传统微生物分析不同的制备方案和平台，且测试仅针对简单的细菌悬浮液进行。也许更适用于食品，初步的基于琼脂的成像技术已使用延时阴影图像分析、高光谱成像技术和数字图像处理开发。这些技术遵循与传统菌落平板计数相同的原理进行微生物菌落计数，可能需要与传统平板计数相同的培养时间，这降低了这些成像技术的效率。为了克服这一问题，光学延时显微镜可能是一种快速且用户友好的解决方案，因为延时测量可以通过微菌落大小的变化提供CFU的早期检测。此外，延时的使用将使得能够区分活的微生物与其他颗粒。
IntuGrow解决方案使用数字延时和明场显微镜方法，由oCelloScope微生物生长动态监测仪实现，结合IntuGrow分析软件可以对微菌落进行计数。oCelloScope微生物生长动态监测仪已成功用于抗菌敏感性测试和功效测试，通过对肉汤中微生物的生长或存活进行延时监测。在本研究中，该仪器检测浑浊液体中微菌落的能力被视为区分卡拉胶引起的噪声与琼脂中发育的微菌落信号的机会。IntuGrow解决方案目前应用于制药行业，基于样品过滤和液体样品直接接种在迷你琼脂平板上，评估生物负载和环境微生物污染。然而，这些技术都不适用于卡拉胶，因为它是一种具有吸湿性质的粉末。
本研究旨在评估IntuGrow解决方案，一种基于延时光学显微镜的新型计数方法，使用迷你琼脂平板对具有挑战性的吸湿性食品样品中的细菌微菌落进行快速计数。初始工作集中在开发一种在迷你琼脂平板中接种吸湿性样品的方法，以及一种能够实现基于图像的生长微菌落检测的软件算法。为了测试所提出方法的适用性，使用配备新软件算法的IntuGrow解决方案在新型"三明治"琼脂装置中对商业卡拉胶样品中的CFU进行计数，并与行业中目前使用的传统平板计数技术进行比较。
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