黑曲霉中幽黑素合成途径、生产、纯化及对UV-C辐射的防护能力
研究背景：载人太空任务面临的一个主要挑战是宇宙辐射和太阳辐射的防护。地球的磁场可以保护我们免受这些辐射的伤害，但在太空旅行中，宇航员需要额外的防护措施。黑曲霉是一种已知的高辐射抗性真菌，广泛应用于生物技术领域。它能够将可再生植物生物质转化为多种产品，如有机酸、蛋白质、酶和次级代谢产物。黑曲霉是一种已知的高辐射抗性真菌，广泛应用于生物技术领域。它能够将可再生植物生物质转化为多种产品，如有机酸、蛋白质、酶和次级代谢产物。此外，黑曲霉在模拟微重力条件下生长良好，其孢子对空间辐射（包括UV-C、宇宙辐射和X射线）具有极高的抵抗力。幽黑素是一种具有抗氧化和自由基清除特性的色素，其结构复杂且具有高度的异质性，能够有效吸收和分散各种形式的辐射，包括紫外线和电离辐射。本研究探索了黑曲霉生产幽黑素的能力，研究中使用了黑曲霉的不同菌株，并通过在培养基中添加L-酪氨酸来诱导幽黑素的过量生产。
通过CRISPR-Cas9技术敲除黑曲霉中的hppD和hmgA基因，以增强幽黑素的生产。通过酸化和冷冻干燥等步骤从培养液中提取幽黑素。使用紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼光谱等方法对幽黑素进行表征。通过DPPH自由基清除实验评估幽黑素的抗氧化能力，并通过UV-C辐射实验评估其辐射防护效果。并通过诱导过量生产来提高产量。同时，评估幽黑素对非电离辐射（如UV-C）的防护效果，并与合成的幽黑素（PyoSyn）进行比较。此外，研究还探讨了幽黑素在生物技术、生物医学和太空探索中的潜在应用价值。研究成功在黑曲霉中诱导生产了幽黑素（PyoFun），并通过光谱分析确认了其结构。PyoFun表现出强大的抗氧化能力，其自由基清除能力约为抗坏血酸的80%。在UV-C辐射实验中，PyoFun对UV-C辐射具有显著的防护效果，尤其是在缺乏DHN-黑色素的菌株中，PyoFun的防护效果更为显著。
丹麦Biosense微生物生长曲线监测系统（oCelloScope™）的应用
oCelloScope™被用于评估黑曲霉孢子在经过UV-C辐射后的生存能力。oCelloScope在本研究中主要应用于孢子萌发与菌丝形成的观察。在辐射实验后，使用oCelloScope™在22°C下对孢子进行48小时的观察。该设备通过数字时间延迟显微技术生成高分辨率的微生物图像，并通过z轴扫描创建一系列图像。oCelloScope™利用内置的SESA真菌算法，通过分析z轴图像上的像素变化，量化孢子萌发和菌丝形成的动态过程。这种方法能够实时监测孢子的生长情况，为评估辐射对孢子生存能力的影响提供了直观的数据支持。通过oCelloScope™的应用，研究人员能够更准确地评估黑曲霉孢子在辐射条件下的生存能力，以及幽黑素对辐射防护的实际效果。
实验结论
通过基因工程手段，成功利用黑曲霉（Aspergillus niger）生产并分泌幽黑素（pyomelanin），并对其抗氧化和辐射防护能力进行了系统评估。黑曲霉菌株OS4.3通过敲除hmgA基因，能够高效生产并分泌幽黑素（PyoFun）。该色素主要存在于细胞外，便于纯化，且产量较高（1.5 g/L培养液）。通过紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼光谱分析，确认了PyoFun的化学结构与合成的幽黑素（PyoSyn）一致，均为黑色素类物质。PyoFun表现出强大的抗氧化能力，其自由基清除能力约为抗坏血酸的80%。纯化的PyoFun比未经纯化的培养上清液具有更高的自由基清除活性，表明纯化过程对提高抗氧化能力至关重要。PyoFun对UV-C辐射具有显著的防护效果，尤其是在缺乏DHN-黑色素的菌株（MA93.1）中，其防护效果更为显著。在1,038 J/m²的UV-C辐射剂量下，PyoFun显著提高了孢子的生存率，而合成的PyoSyn则未表现出显著的防护效果。
图1、研究的实验工作流程图。展示了研究的整体流程，包括黑曲霉菌株的培养、幽黑素（PyoFun）的生产、纯化、光谱分析、抗氧化测试以及辐射屏蔽测试等步骤。
图2、A）幽黑素生物合成途径；（B）黑曲霉菌株的生长表型。图(A)展示了黑曲霉中幽黑素形成的生物合成途径，包括关键基因和代谢产物。图(B)展示了在含有L-酪氨酸的培养基中培养时，野生型和基因敲除突变株（hppD和hmgA）的生长表型差异。
图3、黑曲霉中幽黑素的生产和纯化。展示了黑曲霉菌株OS4.3在含有L-酪氨酸的培养基中培养后，通过酸化和冷冻干燥步骤纯化出的幽黑素（PyoFun）的过程。
图4、幽黑素的物理化学特性。展示了PyoFun在不同溶剂中的溶解性测试结果，以及在过氧化氢处理后的褪色情况，表明PyoFun具有抗氧化活性。
图5、幽黑素对UV-C辐射的防护能力。应用ocelloScope展示了黑曲霉野生型（N402）和DHN-黑色素缺陷型（MA93.1）孢子在经过PyoFun和PyoSyn保护后，对UV-C辐射的耐受性的生长过程。结果显示，PyoFun显著提高了孢子的生存率，尤其是在DHN-黑色素缺陷型菌株中。
总结
黑曲霉（Aspergillus niger）作为一种细胞工厂用于生产具有紫外线（UV-C）辐射屏蔽活性的幽黑素（pyomelanin）。黑曲霉（Aspergillus niger）是一种已知的高辐射抗性真菌，广泛应用于生物技术领域，是生产黑色素的候选菌株。本研究通过在重组的ΔhmgA突变株（OS4.3）中诱导过量生产色素，研究了黑曲霉中真菌幽黑素（PyoFun）的生产。通过三种光谱方法对PyoFun色素进行了表征，并通过DPPH自由基清除实验评估了其抗氧化特性。此外研究人员还评估了PyoFun对非电离辐射（单色UV-C）的保护效果，并将其与合成的对照幽黑素（PyoSyn）进行了比较。oCelloScope™在本研究中被用于评估黑曲霉孢子在经过UV-C辐射后的生存能力，使用oCelloScope™在22°C下对孢子进行48小时的观察，通过实时监测孢子的生长情况，为评估辐射对孢子生存能力的影响提供了直观的数据支持。结果证实了通过诱导过量生产在黑曲霉中成功生产了PyoFun。光谱方法的表征确认了PyoFun的存在，DPPH实验显示了其强大的抗氧化特性。此外PyoFun在抵御辐射诱导的应激方面表现出高度的保护效果，超过了PyoSyn的保护效果。本研究结果表明，PyoFun作为一种生物屏蔽剂对抗有害辐射具有显著潜力。值得注意的是，PyoFun是胞外合成的，这使其与其他真菌黑色素（如L-DOPA或DHN黑色素）不同，后者需要细胞裂解才能纯化色素。这一特性使PyoFun成为生物技术、生物医学和太空工业的宝贵资源。然而仍需进一步研究以评估其在干燥形式下以及对电离辐射的保护效果。未来的研究需要进一步探索PyoFun在干燥形式下的防护效果，以及其对电离辐射的防护能力。这项研究不仅展示了黑曲霉在生产具有辐射防护能力的幽黑素方面的潜力，还为未来的太空探索和生物医学应用提供了新的思路。
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