细菌生长曲线测定：分光光度计vs酶标仪、集中vs试管、实时vs终点
【摘要】
目的：改良细菌生长曲线测定方法，系统评估检测设备（分光光度计vs酶标仪）、培养方式（集中vs试管）及检测时序（实时vs终点）对细菌生长曲线测定的影响。
方法：以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为模式菌株，采用三因素正交实验设计（8种组合），通过分光光度计（OD600）与酶标仪（OD630）测定光密度值，绘制生长曲线并分析设备间相关性、时序等效性及培养稳定性。
结果：不同方法组合的生长曲线呈高度正相关（P<0.01）；实时检测与冷藏终点检测的OD值比较差异无统计学意义（P>0.05）。优化后的试管培养-终点酶标仪（OD630）检测法通过预混接种标准化和单管连续取样，使曲线平滑度明显提升。
结论：基于试管预混培养、4℃冷藏终点检测及酶标仪高通量分析（OD630）的组合方法，可同步提升操作效率与数据一致性，为细菌生长曲线测定提供优化方案。
微生物的生长与繁殖遵循一定的规律性，其生长曲线通常可划分为四个阶段：延迟期、对数期、稳定期和衰亡期。细菌生长曲线作为描述细菌在特定培养条件下生长规律的关键工具，其准确测定对于生产实践具有重要的指导价值。通过测定细菌生长曲线，可以掌握细菌的生长速率、繁殖能力、代谢活性以及对外界环境的适应性等关键信息。
然而，传统的细菌生长曲线测定方法存在局限性。大肠埃希菌生长曲线的测定在多数微生物学实验教材中有所介绍，且通常采用相似的实验方案。光电比浊法因其简便和快速而被广泛采用，成为测定大肠埃希菌生长曲线的常用方法。但在实际应用中，将大肠埃希菌生长曲线的测定方法应用于其他微生物时，可能会遇到意料之外的困难和问题。例如，传统方法通常采用多瓶培养并分别取样测定的方式，这种方法不仅操作繁琐，而且由于接种量的差异，可能导致测定结果不准确。此外，传统方法还存在时间分辨率低、效率低和劳动力需求高等缺陷，这限制了其在高通量实验和大规模筛选中的应用。此外，不同检测设备（如分光光度计与酶标仪）的测量差异，以及样品储存条件（即时检测与冷藏后检测）对OD值的影响尚未系统评估。
因此，对细菌生长曲线测定方法进行改良具有重要意义。本研究旨在优化细菌生长曲线测定方法，系统评估检测设备（分光光度计vs酶标仪）、培养方式（集中vs试管）及检测时序（实时vs终点）对细菌生长曲线测定的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本研究采用两种模式菌株：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌；培养基选用营养肉汤培养基（nutrient broth, NB）（北京百奥莱博，20191025）；主要仪器为分光光度计（上海菁华-721型）、酶标仪（普朗DNM-9602G）、恒温摇床（苏州国飞YHZ-112）。
1.2 实验方法
1.2.1 细菌种子液制备
（1）大肠埃希菌：取对数生长期的纯培养菌株，接种于100 mL营养肉汤培养基，于37℃、200 r/min条件下恒温振荡培养18 h，制备种子液。（2）金黄色葡萄球菌：种子液制备方法同大肠埃希菌。
1.2.2 初实验测定生长曲线
通过三因素（细菌培养方式、取样检测时序和OD值检测设备）组合实验测定细菌生长曲线，每因素包含两种方法，采用三因素正交实验设计，共形成8种组合实验。见表1。
表1 测定细菌生长曲线的8种组合实验方法
| 方法代号 | 细菌培养方式 | 取样检测时序 | OD值检测设备 |
|---|---|---|---|
| A | 集中培养 | 实时检测 | 分光光度计（OD600） |
| B | 集中培养 | 实时检测 | 酶标仪（OD630） |
| C | 集中培养 | 终点检测 | 分光光度计（OD600） |
| D | 集中培养 | 终点检测 | 酶标仪（OD630） |
| E | 试管培养 | 实时检测 | 分光光度计（OD600） |
| F | 试管培养 | 实时检测 | 酶标仪（OD630） |
| G | 试管培养 | 终点检测 | 分光光度计（OD600） |
| H | 试管培养 | 终点检测 | 酶标仪（OD630） |
1.2.2.1 细菌培养方式
（1）集中培养法：将种子液按1%接种量接种于300 mL NB培养基中，37℃、200 r/min振荡培养24 h。培养期间每间隔2 h从培养瓶中取5 mL菌液检测（取样时间点：0, 2, 4, …, 24 h）。（2）试管培养法：将NB培养基分装至13支15 mL无菌试管（每管5 mL），按1%接种量分别接种种子液并混匀，相同条件下培养。每间隔2 h取1支试管菌液检测（取样时间点同上）。
1.2.2.2 取样检测时序
（1）实时检测：取样后立即测定。（2）终点检测：取样后菌液于4℃保存，待24 h取样完成后统一测定。
1.2.2.3 OD值检测设备
（1）分光光度计法：取2 mL菌液，以无菌NB培养基为空白对照，测定OD600值。（2）酶标仪法：取200 μL菌液加入无菌酶标板孔中，以无菌营养肉汤培养基为空白对照，测定OD630值。
1.2.3 优化验证实验
基于初实验结果（8种组合方法差异无统计学意义），从方法简化角度选择G（试管培养-终点检测-分光光度计OD600）和H（试管培养-终点检测-酶标仪OD630）进行优化对比。改进内容如下：（1）试管培养法优化-预混接种法：将种子液按1%接种量与肉汤培养基混合后，以5 mL/支分装至15 mL无菌试管中培养，确保各试管初始接种量一致。（2）取样连续性优化—单培养瓶连续取样：改进前采用“两段式无缝衔接培养法”（前12 h与后12 h菌液分别来自两个独立培养瓶）；改进后从同一培养瓶中连续取样24 h，避免多瓶差异干扰。
为保持与初实验条件一致，两种优化方法（G、H）仍采用终点检测法：（1）OD600检测：取5 mL菌液，以无菌营养肉汤为空白，分光光度计测定。（2）OD630检测：取200 μL菌液加入无菌酶标板孔中，以相同空白对照测定。
1.2.4 统计分析
所有实验均独立重复3次。采用SPSS 24.0进行统计学分析，GraphPad Prism 9.5绘制生长曲线。组间差异性比较采用两独立样本t检验，采用双变量皮尔逊（Pearson）相关性分析生长曲线变化趋势是否一致，以P<0.05为差异具有统计学意义。
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