摘要：【目的】应用一种昆虫细胞培养基作为基础成分培养巴尔通体（Bartonella species），建立一种操作方便、高效稳定的巴尔通体液体培养方法。【方法】昆虫细胞培养基中添加10%胎牛血清，以此为基础培养液分别添加蔗糖和谷氨酰胺，比较这两种成分对汉赛巴尔通体（B. henselae）和五日热巴尔通体（B. quintana）生长的影响并观察其他10种巴尔通体在简化后的培养液中的生长特性。采用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统实时监测细菌培养液在600 nm波长下的光密度（OD₆₀₀），自动记录生长曲线。【结果】添加蔗糖和谷氨酰胺不会明显促进巴尔通体的生长，10种巴尔通体在简化后的培养液中均生长良好。不同种巴尔通体生长曲线不同，汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体的世代时间分别为5.2 h和4.3 h，生长速度快于固体培养。【结论】以昆虫细胞培养基作为基础成分的培养液适于巴尔通体液体培养，特别是对一些更难培养的巴尔通体提供了一种较好的培养方法。

巴尔通体（Bartonella species）是营养要求苛刻、兼性细胞内寄生的革兰氏阴性需氧杆菌，主要寄生在动物宿主和人的血管内皮细胞和红细胞内，能够引起人类猫抓病（汉赛巴尔通体 B. henselae 和克氏巴尔通体 B. clarridgeiae）、战壕热（五日热巴尔通体 B. quintana）、心内膜炎（汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、伊丽莎白巴尔通体 B. elizabethae、克勒巴尔通体 B. koehlerae、文森巴尔通体博格霍夫亚种 B. vinsonii subsp. berkhoffii 等）、卡瑞恩病（杆菌样巴尔通体 B. bacilliformis）和其他系统性病变等。巴尔通体体外培养生长缓慢，常规的固体培养必需添加动物全血才能生长，原代培养通常需要5–30 d。与传统的固体培养方法相比，液体培养方法无需添加动物全血，使用方便、快捷。从生物学角度考虑，液体培养环境更接近于巴尔通体在宿主体内的生境，因此，建立稳定的液体培养方法，对于研究其代谢机制、致病机制、对药物的敏感性及耐药机制等方面非常重要。本研究选择一种昆虫细胞培养基（Schneider's insect medium, SIM），观察添加蔗糖和谷氨酰胺是否能够促进巴尔通体生长，以简化巴尔通体液体培养，并测定不同种巴尔通体的生长曲线，进一步掌握巴尔通体的生长规律。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

昆虫细胞培养基SIM，Sigma，美国；标准胎牛血清（FCS），天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；蔗糖，北京化工厂；谷氨酰胺，AMRESCO，美国；胰酶大豆肉汤（TSB）和胰酶大豆琼脂培养基（TSA），BD，美国。

1.2 主要仪器

371型CO₂培养箱，Thermo Scientific，美国；脱色摇床，TECHNE，英国；丹麦Biosense微生物生长动态监测系统（用于实时OD₆₀₀监测）；5804R台式高速冷冻离心机，Sigma，美国。

1.3 实验菌株

特利波契巴尔通体（B. tribocorum）由巴塞尔大学Christoph Dehio教授惠赠，其他巴尔通体标准菌株均来源于美国标准生物品收藏中心ATCC（表1）。

1.4 常规培养

应用含5%羊血的TSA复苏培养巴尔通体菌株，培养条件为5% CO₂、潮湿环境中35 °C培养4–6 d。Bb培养温度为28 °C和35 °C。

1.5 液体培养

1.5.1 培养液制备

参照文献，基础成分为SIM和10%胎牛血清，谷氨酰胺和蔗糖为添加成分。应用灭菌超纯水配制谷氨酰胺和蔗糖溶液，0.22 μm滤器过滤除菌后加入培养液，终浓度分别为2 mmol/L和5%（W/V），混匀后吸取0.1 mL培养液涂布于TSA平板上培养检测是否污染。

1.5.2 培养方法

将培养第4–6天的菌体接种于上述液体培养基混匀，取OD值为0.4–0.5的菌液0.2 mL加入到装有19.8 mL培养液的75 cm²细胞培养瓶中，混匀后立即转移至Biosense专用培养管（或微孔板）中，每管分装2 mL，设置3个平行。将培养管放入Biosense监测系统中，置于5% CO₂培养箱内，35 °C振荡培养（30 r/min）9 d。Bb培养温度为28 °C和35 °C。系统每30 min自动测定OD₆₀₀并记录数据。

1.5.3 生长曲线测定

（1）OD值测定：采用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统实时监测培养液在600 nm波长下的光密度，自动采集数据，以同样培养条件下未加细菌的培养液作为空白对照，系统自动扣除背景并绘制生长曲线。

（2）细菌生长量（CFU）测定：接种培养后每天定时从Biosense培养管中无菌取出10 μL培养液，加入90 μL TSB中做梯度稀释（10⁻¹–10⁻¹⁰），每个稀释度取10 μL接种到TSA平板上3份，置于35 °C、5% CO₂培养箱中培养，计数菌落生长的平均数。该数据用于验证OD值与活菌数的对应关系。

1.5.4 菌体湿重测定

2655 g离心10 min收集菌体，PBS洗3次后离心称重。

1.5.5 世代时间计算

依据公式 G = (t₂ − t₁) / [(log W₁ − log W₂) / lg 2] 计算巴尔通体的世代时间，公式中 G 为世代时间（Generation time），t₁ 和 t₂ 为所取对数期两点的时间；W₁ 和 W₂ 分别为相应时间测得的细胞浓度（CFU/mL）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量数据之间的差异比较采用t检验和方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

表1 实验菌株

菌株名称 Species	缩写 Abbreviation	菌株名称 Strain name	菌种编号（来源） Collection No. (Source)	分离地 Geographic origin	宿主 Primary reservoir
汉赛巴尔通体 B. henselae	Bh	Houston-1	ATCC 49882(人)	美国德克萨斯州	猫
五日热巴尔通体 B. quintana	Bq	Fuller	VR-358(人)	前南斯拉夫	人
克氏巴尔通体 B. clarridgeiae	Bc	Houston-2 cat	51734(猫)	美国德克萨斯州	猫
克勒巴尔通体 B. koehlerae	Bk	C-29	700693(猫)	美国加利福尼亚	猫
杆菌样巴尔通体 B. bacilliformis	Bb	KC583	35685(人)	秘鲁	人
文森巴尔通体博格霍夫亚种 B. vinsonii subsp. berkhoffii	Bvb	NCSU 93-CO1	51672TM(犬)	美国北卡罗来纳州	犬
文森巴尔通体阿鲁潘亚种 B. vinsonii subsp. arupensis	Bva	OK 94-513	700727(人)	美国怀俄明州	鼠
文森巴尔通体文森亚种 B. vinsonii subsp. vinsonii	Bvv	Baker	VR-152(鼠)	加拿大魁北克	鼠
伊丽莎白巴尔通体 B. elizabethae	Be	F9251	49927(人)	美国马萨诸塞州	鼠
格拉汉姆巴尔通体 B. grahamii	Bg	NCTC 12860	700132(鼠)	英国	鼠
道志巴尔通体 B. doshiae	Bd	NCTC 12862	700133(鼠)	英国	鼠
特利波契巴尔通体 B. tribocorum	Bt	IBS 506	CIP 105476(鼠)	法国	鼠

（图注：培养液为含10% FCS昆虫细胞培养基；+Gln和−Gln分别表示添加和不添加谷氨酰胺；曲线由Biosense系统实时监测获得，每30 min记录一点。）

相关新闻推荐

1、DAPI荧光染色计数法：不同保藏方式时间对海洋微型底栖生物计数结果的影响——摘要、材料与方法

2、菌株双控制生长开关及其应用的遗传稳定性（二）

3、国内新发病原牛疱疹病毒4型(BoHV-4)qPCR鉴定、分离及一步生长曲线测定（二）

4、羊致病性链球菌病对孢他定、磺胺间甲氧嘧啶5种药物高度敏感性研究

5、中药成分焦性没食子酸联合唑类药物对光滑念珠菌的抑菌机制与药效