摘要：【目的】应用一种昆虫细胞培养基作为基础成分培养巴尔通体（Bartonella species），建立一种操作方便、高效稳定的巴尔通体液体培养方法。【方法】昆虫细胞培养基中添加10%胎牛血清，以此为基础培养液分别添加蔗糖和谷氨酰胺，比较这两种成分对汉赛巴尔通体（B. henselae）和五日热巴尔通体（B. quintana）生长的影响并观察其他10种巴尔通体在简化后的培养液中的生长特性。采用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统实时监测细菌培养液在600 nm波长下的光密度（OD₆₀₀），自动记录生长曲线。【结果】添加蔗糖和谷氨酰胺不会明显促进巴尔通体的生长，10种巴尔通体在简化后的培养液中均生长良好。不同种巴尔通体生长曲线不同，汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体的世代时间分别为5.2 h和4.3 h，生长速度快于固体培养。【结论】以昆虫细胞培养基作为基础成分的培养液适于巴尔通体液体培养，特别是对一些更难培养的巴尔通体提供了一种较好的培养方法。

巴尔通体（Bartonella species）是营养要求苛刻、兼性细胞内寄生的革兰氏阴性需氧杆菌，主要寄生在动物宿主和人的血管内皮细胞和红细胞内，能够引起人类猫抓病（汉赛巴尔通体 B. henselae 和克氏巴尔通体 B. clarridgeiae）、战壕热（五日热巴尔通体 B. quintana）、心内膜炎（汉赛巴尔通体、五日热巴尔通体、伊丽莎白巴尔通体 B. elizabethae、克勒巴尔通体 B. koehlerae、文森巴尔通体博格霍夫亚种 B. vinsonii subsp. berkhoffii 等）、卡瑞恩病（杆菌样巴尔通体 B. bacilliformis）和其他系统性病变等。巴尔通体体外培养生长缓慢，常规的固体培养必需添加动物全血才能生长，原代培养通常需要5–30 d。与传统的固体培养方法相比，液体培养方法无需添加动物全血，使用方便、快捷。从生物学角度考虑，液体培养环境更接近于巴尔通体在宿主体内的生境，因此，建立稳定的液体培养方法，对于研究其代谢机制、致病机制、对药物的敏感性及耐药机制等方面非常重要。本研究选择一种昆虫细胞培养基（Schneider's insect medium, SIM），观察添加蔗糖和谷氨酰胺是否能够促进巴尔通体生长，以简化巴尔通体液体培养，并测定不同种巴尔通体的生长曲线，进一步掌握巴尔通体的生长规律。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

昆虫细胞培养基SIM，Sigma，美国；标准胎牛血清（FCS），天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；蔗糖，北京化工厂；谷氨酰胺，AMRESCO，美国；胰酶大豆肉汤（TSB）和胰酶大豆琼脂培养基（TSA），BD，美国。

1.2 主要仪器

371型CO₂培养箱，Thermo Scientific，美国；脱色摇床，TECHNE，英国；丹麦Biosense微生物生长动态监测系统（用于实时OD₆₀₀监测）；5804R台式高速冷冻离心机，Sigma，美国。

1.3 实验菌株

特利波契巴尔通体（B. tribocorum）由巴塞尔大学Christoph Dehio教授惠赠，其他巴尔通体标准菌株均来源于美国标准生物品收藏中心ATCC（表1）。

1.4 常规培养

应用含5%羊血的TSA复苏培养巴尔通体菌株，培养条件为5% CO₂、潮湿环境中35 °C培养4–6 d。Bb培养温度为28 °C和35 °C。

1.5 液体培养

1.5.1 培养液制备

参照文献，基础成分为SIM和10%胎牛血清，谷氨酰胺和蔗糖为添加成分。应用灭菌超纯水配制谷氨酰胺和蔗糖溶液，0.22 μm滤器过滤除菌后加入培养液，终浓度分别为2 mmol/L和5%（W/V），混匀后吸取0.1 mL培养液涂布于TSA平板上培养检测是否污染。

1.5.2 培养方法

将培养第4–6天的菌体接种于上述液体培养基混匀，取OD值为0.4–0.5的菌液0.2 mL加入到装有19.8 mL培养液的75 cm²细胞培养瓶中，混匀后立即转移至Biosense专用培养管（或微孔板）中，每管分装2 mL，设置3个平行。将培养管放入Biosense监测系统中，置于5% CO₂培养箱内，35 °C振荡培养（30 r/min）9 d。Bb培养温度为28 °C和35 °C。系统每30 min自动测定OD₆₀₀并记录数据。

1.5.3 生长曲线测定

（1）OD值测定：采用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统实时监测培养液在600 nm波长下的光密度，自动采集数据，以同样培养条件下未加细菌的培养液作为空白对照，系统自动扣除背景并绘制生长曲线。

（2）细菌生长量（CFU）测定：接种培养后每天定时从Biosense培养管中无菌取出10 μL培养液，加入90 μL TSB中做梯度稀释（10⁻¹–10⁻¹⁰），每个稀释度取10 μL接种到TSA平板上3份，置于35 °C、5% CO₂培养箱中培养，计数菌落生长的平均数。该数据用于验证OD值与活菌数的对应关系。

1.5.4 菌体湿重测定

2655 g离心10 min收集菌体，PBS洗3次后离心称重。

1.5.5 世代时间计算

依据公式 G = (t₂ − t₁) / [(log W₁ − log W₂) / lg 2] 计算巴尔通体的世代时间，公式中 G 为世代时间（Generation time），t₁ 和 t₂ 为所取对数期两点的时间；W₁ 和 W₂ 分别为相应时间测得的细胞浓度（CFU/mL）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量数据之间的差异比较采用t检验和方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

表1 实验菌株

菌株名称 Species	缩写 Abbreviation	菌株名称 Strain name	菌种编号（来源） Collection No. (Source)	分离地 Geographic origin	宿主 Primary reservoir
汉赛巴尔通体 B. henselae	Bh	Houston-1	ATCC 49882(人)	美国德克萨斯州	猫
五日热巴尔通体 B. quintana	Bq	Fuller	VR-358(人)	前南斯拉夫	人
克氏巴尔通体 B. clarridgeiae	Bc	Houston-2 cat	51734(猫)	美国德克萨斯州	猫
克勒巴尔通体 B. koehlerae	Bk	C-29	700693(猫)	美国加利福尼亚	猫
杆菌样巴尔通体 B. bacilliformis	Bb	KC583	35685(人)	秘鲁	人
文森巴尔通体博格霍夫亚种 B. vinsonii subsp. berkhoffii	Bvb	NCSU 93-CO1	51672TM(犬)	美国北卡罗来纳州	犬
文森巴尔通体阿鲁潘亚种 B. vinsonii subsp. arupensis	Bva	OK 94-513	700727(人)	美国怀俄明州	鼠
文森巴尔通体文森亚种 B. vinsonii subsp. vinsonii	Bvv	Baker	VR-152(鼠)	加拿大魁北克	鼠
伊丽莎白巴尔通体 B. elizabethae	Be	F9251	49927(人)	美国马萨诸塞州	鼠
格拉汉姆巴尔通体 B. grahamii	Bg	NCTC 12860	700132(鼠)	英国	鼠
道志巴尔通体 B. doshiae	Bd	NCTC 12862	700133(鼠)	英国	鼠
特利波契巴尔通体 B. tribocorum	Bt	IBS 506	CIP 105476(鼠)	法国	鼠

（图注：培养液为含10% FCS昆虫细胞培养基；+Gln和−Gln分别表示添加和不添加谷氨酰胺；曲线由Biosense系统实时监测获得，每30 min记录一点。）

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