抗生素敏感性试验方法的研究进展与新技术展望
抗生素耐药性被定义为细菌编码耐药基因的遗传能力，这些耐药基因正时刻削弱抗生素的功效。它既可以通过自然重组和整合进入细菌基因组，也可以通过结合、转化和转导等水平基因突变事件获得。细菌耐药性产生的主要事件包括孔蛋白通道的失活、抗生素靶点的修饰以及通过酶作用中和抗生素的作用。因此，了解细菌的遗传改造和形态解剖学变化对研究抗耐药性机制至关重要。
抗生素的发现改变了人们的思维模式，因为它不仅是对抗慢性感染的有效工具，而且为制药行业开辟了新的途径。2022年版全球与中国抗生素市场调研与发展趋势预测分析报告中指出，2010 ~ 2020年期间，抗生素消费量增长了37%，目前抗生素产业规模为896亿美元（截至2020年）。俄罗斯、印度、中国、巴西和南非是抗生素消费量增长的主要来源国，据估计，这些国家的抗生素消费量增长了86%。2010 ~ 2020年期间，抗生素消费增加所经历的变化仍然是前所未有的，这主要是新疾病出现的结果。另一方面，抗生素消费和工业化的增加可能是由于患者过度使用或滥用医生建议的抗感染时的自我用药。世界卫生组织最近一份关于抗生素耐药性有关死亡的全球抗生素耐药监测报告指出，目前每年有70万人死亡，并预测到2050年每年将有1000万人死亡。除此之外，世卫组织还警告了抗生素耐药性的严重性，称“它威胁到现代医学的成就，一个后抗生素时代——在这个时代，常见的感染和轻微的伤害可以致命——是21世纪非常现实的问题。”
美国临床和实验室标准协会（CLSI）基于药代动力学-药理学（PK-PD）特性和耐药的机制制定了《抗微生物药物敏感性试验的执行标准》，大多数国家实验室标准是基于PK-PD特征的MIC临界值（最低抑菌浓度）和由欧洲抗生素微生物药敏感性试验委员会（EUCAST）确定的流行病学MIC临界值（ECOFFs）。EUCAST推荐的MIC临界值一般高于CLSI。由于美国临床和实验室标准协会（CLSI）《微生物敏感性试验的执行标准》与最低抑菌浓度临界值的修改，结果发生了重大变化，如肺炎克雷伯菌和肠ESBLs。大肠杆菌一直在引起头孢他啶的耐药性面临严重的威胁。
几十年来一直协助围剿抗生素耐药性所遭受着严重的发展。由于抗生素的过度使用造成了细菌的巨大挑战以及药物开发大大减少，世卫组织对社会造成了一份倡议书《优先病原菌》，并将其区分为关键优先病原菌、高度优先和中度优先菌。抗革兰氏阴性球菌的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌[1-2]和第三代头孢菌素耐药肠杆菌科细菌被列为关键优先病原菌。关键的细菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素的屎肠球菌、耐氟喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌、耐碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌、耐青霉素的流感嗜血杆菌、对β-内酰胺酶稳定的青霉素（氨苄西林-克拉维酸钾）的耐药性非常普遍，而对于突变，万古霉素和替加环素的耐药性则比其他细菌少。由于突变，所有细菌和引起的感染可能表现出比以前的更严重的结果。尽管微生物学家们在这些耐药菌中显示出了很大的希望，但耐药菌的快速检测仍然是一个巨大的挑战。
本文回顾了AST的表型分析方法，如扩散法、稀释法和自动AST工具。本文讨论了基于基因型的AST方法，包括基于聚合酶链式反应（PCR）和DNA芯片的敏感性分析。然后，概述了几种分子方法，如荧光光、比色法和电化学微流控传感器及其相关注意事项。
1.1 扩散法
纸片扩散法是确定细菌敏感性的标准。1956年，鲍尔和科比的实验[3]里选择分离的细菌，悬浮在生长培养基中，通过速度测试，并将标准化后的悬液接种到凝固的琼脂平板上。将抗生素浸入经过测试的纸片上。装有抗生素的纸片可以通过测量在琼脂平板上形成的冷却带的大小、抑制圈的大小和方向来定量[3]。评估和确定细菌的敏感性通常需要16 ~ 24 h。在1961年，世卫组织提出方案来解决对抗细菌敏感性测定方法的需要。后来，1966年，鲍尔和科比的纸片扩散法被确定为敏感性试验的标准方法。该方法可用于临床实验室药敏常规检测。此外，该方法由于具有单一、经济有足够的多项目检测的优良而被广泛接受。然而，除了这些优点外，它可常常使其适于食品和药物。在不同物理条件下方便地释放MIC的能力，成为临床实验室中标准化的琼脂扩散和稀释技术的首选方法。
20世纪90年代，对渗透检测法与其他标准化技术如琼脂稀释和肉汤稀释等的比较研究确立了该试验的意义。对临床分离的嗜门螺杆菌、淋球菌、肠球菌等进行了测试检测，并与标准方法进行了比较，相关性在91% ~ 99%范围内良好。肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌和肠球菌的金黄色葡萄球菌分离株采用头孢他啶MIC测定试验，将结果与微量肉汤稀释法进行了比较，结果显示良好的一致性超过95%。同时对弯曲杆菌的7种抗菌药物的耐药性进行多重培养，确定他们抗药物的耐药性。这些结果表明，该方法在评价多种抗生素的MIC值方面具有可靠性和重要性，特别是对生长缓慢的细菌（空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌）和罕见的致病菌（肺炎链球菌和奈瑟氏菌）。该测试的一个重要优势是它的敏感性，它可以检测超β-内酰胺酶，即使在微量下。此外，由于检测条上标记的抗生素浓度梯度稳定，在临床实验室中容易准确地确定抗生素液体。
除了几个优点之外，也有一些不可忽视的局限性，主要与某些抗菌药如氨苄西林、环丙沙星、氧氟沙星、利福平的检测不准确和不一致有关。使常规检测分析变得复杂的其他一些缺点。pH值、缓冲涂层和琼脂的脱水等。另一方面，它允许平板接种和培养的实验室设置。
图1展示了各种传统抗微生物敏感性试验方法的代表：a) 纸片扩散、b) 琼脂稀释、c) 肉汤稀释、d) 微量肉汤稀释和e) 自动化系统
注：a) 纸片扩散法的原理是通过抗生素从纸片中扩散出来，在琼脂平板上形成浓度梯度，从而抑制细菌生长；b) 琼脂稀释法是将抗生素混入琼脂培养基中，形成一系列不同浓度的抗生素梯度；c) 肉汤稀释法是将抗生素加入肉汤培养基中，形成一系列不同浓度的抗生素梯度；d) 微量肉汤稀释法是在微量滴定板中进行肉汤稀释，通过肉眼观察细菌生长情况来确定MIC；e) 自动化系统是利用自动化仪器进行细菌培养和药物敏感性测试，通过光学或比色法检测细菌生长情况，并自动判断MIC值。
相关新闻推荐
1、稻花香馫香型根霉曲、中高温大曲和高温大曲的酶活力和微生物数量统计（上）