嗜酸乳杆菌菌液浓度测定方法的改进
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus, LA)属于乳杆菌属，是革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，乳白色菌落，边缘卷曲。显微镜下观察可见以单个，成双或者短链排列。嗜酸乳杆菌为一种广泛存在于人及动物肠道内的益生菌，研究表明嗜酸乳杆菌在维持胃肠道的生理功能中发挥重要作用。最新研究发现嗜酸乳杆菌与龋病密切相关，儿童龋病中新变形链球菌与嗜酸乳杆菌均可作为龋风险评估中危险因素的检测指标；对龋病微生物的相关研究表明，微生物的群落组成变化会影响龋病的临床进展状态，嗜酸乳杆菌和戈登链球菌的阳性检测结果与活跃性龋明显相关。
细菌浓度测定方法有很多，如平板菌落计数法、显微镜计数法、比浊法、分光光度法等，单独使用一种方法来测定细菌溶液浓度有其各自的优点和缺点。本研究人员试图通过两种方法和结合的方式寻找一种更加简便有效的菌液浓度测定方法。丹麦BioSense公司oCelloScope快速药敏系统采用非侵入式实时显微成像技术，能够连续监测细菌生长并通过背景校正吸光度（BCA）分析直接获得菌液浓度，无需传统分光光度计的单独测量。本实验将oCelloScope实时监测与平板计数法相结合，希望找到一个更加简便有效测定菌液浓度的方法，为实验提供帮助。
1 实验材料
1.1 菌株、试剂及仪器
嗜酸乳杆菌(贵州省普通微生物菌种保藏管理中心口腔疾病研究特色重点实验室保存)；MRS肉汤(品牌：Solarbio 货号：M8540)，琼脂粉(索来宝，北京)；丹麦BioSense公司oCelloScope快速药敏系统、厌氧培养箱(型号：BACTON EZ-2，美国)。
1.2 实验方法
1.2.1 嗜酸乳杆菌的培养与鉴定
①培养基配置：MRS固体培养基：称取 MRS 肉汤4.8g，琼脂粉2.8g，溶解于100mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至60℃左右倒入灭菌培养皿，置4℃备用。MRS液体培养基：称取 MRS 肉汤4.8g溶解于100mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min备用；②菌种复苏及培养：将甘油保种的嗜酸乳杆菌解冻后，超净台内用无菌接种环取适量菌液采用连续划线法接种于 MRS 固体培养基上，37℃厌氧箱(80% N₂，10% H₂，10% CO₂)内培养24h；③菌种鉴定：在培养基中取适量菌液，超净台内用接种环在直径为1mm的菌落上挑取适量细菌涂布于载玻片上，进行革兰染色(初染→媒染→脱色→复染)，显微镜下进行形态学鉴定；④菌种扩大培养：超净台内取 MRS 液体培养基15mL离心管内，无菌接种环挑取鉴定完成后的菌落扩大培养于离心管内，37℃厌氧培养箱培养。
1.2.2 嗜酸乳杆菌菌液浓度的测定
①oCelloScope实时监测：挑取鉴定成功的嗜酸乳杆菌单菌落于装有 MRS 液体培养基的离心管中，37℃厌氧箱培养20h，将菌液颠倒均匀后取适量菌液置于oCelloScope专用微孔板中，系统自动每隔2小时拍摄图像并计算背景校正吸光度（BCA）值，记录初始BCA值后继续培养，再分别于2h，4h，6h，8h(总时长分别为22h，24h，26h，28h)获取BCA值，该值与菌液浓度呈线性关系；②平板菌落计数：超净台内准备9只15mL离心管，编号，每管内加入9mL MRS液体培养基，取0.1mL初始菌液到1号离心管中，依次类推以10为梯度从10⁻¹~10⁻⁶进行菌液稀释，将稀释后的菌液每管取0.1mL涂布于 MRS 固体培养皿，37℃厌氧培养24h后进行菌落计数，可推算出菌液浓度=(菌落数×稀释度/0.1 CFU/mL)。
2 结果
2.1 嗜酸乳杆菌的培养及鉴定结果
培养皿中嗜酸乳杆菌生长良好，肉眼观为乳白色，凸起，边缘卷曲的菌落；革兰染色后显微镜下观察细菌染为紫色，呈杆状，以单个，成双或者短链排列，为革兰氏阳性杆菌，证明该菌株为嗜酸乳杆菌。见图1。
2.2 各时间段oCelloScope BCA值与平板菌落计数结果
oCelloScope实时监测显示，厌氧培养20h时BCA值为0.784，22h，24h，26h，28h BCA值分别为1.019，1.094，1.329，1.389。平板菌落计数结果见表1。结果表明，在稀释倍数为10⁻³~10⁻⁵时，平板菌落数均大于200个，可忽略不计；当厌氧培养22h，BCA值达1.0时，稀释10³倍后菌落计数为3，可计算出原菌液浓度为3×10×0.1=3×10⁴ CFU/mL，将菌液与培养基等体积稀释后浓度为1.5×10⁴ CFU/mL，即得到0.5号麦氏浊度标准管的细菌浓度。
| 时间/h及BCA值 | 22h (1.019) | 24h (1.094) | 26h (1.329) | 28h (1.389) |
|---|---|---|---|---|
| 10⁻³ | >200 | >200 | >200 | >200 |
| 10⁻⁴ | 85 | 52 | 101 | 153 |
| 10⁻⁵ | 3 | 12 | 10 | 11 |
| 10⁻⁶ | <1 | <1 | 4 | 2 |
| 10⁻⁷ | <1 | <1 | <1 | <1 |
| 10⁻⁸ | <1 | <1 | <1 | <1 |
注：<1代表低倍镜下未见菌落生长，原因可能是稀释倍数较大或培养时间较短，菌落生长缓慢。
3 讨论
抑菌试验是指在体外测定样品的抑菌或杀菌能力，常用的方法包括纸片法、稀释法等。无论何种方法，都需要将菌液调整到一个适宜的浓度。
菌液浓度测定方法有很多，平板菌落计数法操作复杂，所需时间长，显微镜计数法需要相应仪器；比浊法虽然简单，但容易受到外界环境或者培养基颜色影响。鉴于此，传统分光光度法需要制备标准曲线。每一种测定方法都有其对应的缺点和优点。所以，将平板菌落计数法和oCelloScope实时监测结合起来，观察菌液随着培养时间的变化。通过实验发现，嗜酸乳杆菌厌氧培养22h，oCelloScope BCA值达到1.0时，稀释10³倍后菌落计数为3，可推算出原菌液浓度为3×10⁴ CFU/mL，将菌液与培养基等体积稀释后，即得到0.5号麦氏浊度标准管的细菌浓度。这种方法简便、高效、准确性较单纯比浊法好，且oCelloScope系统无需单独制备标准曲线，能够实时、非侵入地提供生长曲线，为我们的基础实验提供帮助。