产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（二）-上海谓载科技有限公司

产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（二）

来源：海洋通报发布时间:2024-12-30 16:05:15 浏览：268 次

1.3产脂肪酶菌株的筛选

吸取10mL水样至100mL灭菌海水中，180r/min、30℃振荡10 min；并在80℃下水浴15 min，取出、静置。吸取10 mL上清菌液至100 mL富集液体培养基中，在180 r/min、30℃下培养。2 d后，吸取5 mL富集培养菌液至100 mL新鲜的富集液体培养基中，进行二次富集，如此连续富集培养3次。吸取1 mL第3次富集培养菌液至9 mL灭菌海水中，依次倍比稀释至10-4；吸取100μL稀释度为10-4的菌液在罗丹明B显色初筛培养基上涂布，挑选在罗丹明B显色初筛培养基上水解圈较大且在350 nm紫外灯下橙黄色荧光亮斑较大的菌落为筛选分离菌株。挑取菌落继续于罗丹明B显色初筛培养基上重复3次划线分离培养，直到菌落形态一致。挑取罗丹明B显色初筛培养基上的单菌落至复筛固体培养基上重复划线培养，直至单菌落不再染上罗丹明B显色剂。挑选在复筛固体培养基上的单菌落至改良产酶发酵培养基中，于200 r/min、30℃下振荡培养48 h，测定筛选得到菌株的产脂肪酶活性，以最优产脂肪酶活性的菌株为目的菌株。

1.4菌株鉴定

1.4.1菌落形态及镜检

挑取纯化单菌落于计数固体培养基上划线，参照沈萍等的方法进行革兰氏染色、芽孢染色（沈萍等，2005）。

1.4.216S rDNA序列测定和分析

单菌落振荡培养18 h后，按照北京艾德莱生物科技有限公司的细菌基因组DNA快速提取试剂盒的说明提取目的菌株DNA，对菌株进行16S rDNA序列的PCR扩增与测序（徐先栋等，2012）。

1.4.3生理生化鉴定

挑取纯化单菌落，参照东秀珠的方法进行VP测定、丙酸盐、淀粉水解、明胶水解、V-P培养物终pH>7、柠檬酸盐、55℃、pH 5.7、pH 6.8、NaCl 5%、NaCl 7%等理化指标试验（东秀珠等，2001）。

1.5活菌总数计数

吸取6 mL目的菌株过夜培养液（于生长培养基中培养10-12 h）转入盛有60 mL生长培养基的三角瓶中，混匀后分别吸取5 mL混合液至标记0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20的12支无菌大试管中。于30℃、250 r/min条件下培养，并于相应时间点将标有对应时间的大试管取出，分别吸取1 mL各个时间点的生长培养菌液至9 mL灭菌海水中，依次倍比稀释至10-5。吸取100μL稀释度为10-5的菌液于计数固体培养基上涂布、计数。

1.6脂肪酶活力的测定

在40℃、pH 7.5条件下，以1 min催化水解反应底物（橄榄油）释放1μmol脂肪酸的酶量定义为1个脂肪酶活力单位（U）（施巧琴，1998）。摇瓶发酵48 h后，吸取发酵上清液于8 000 r/min、4℃下离心5 min，吸取上清酶液备用，参照李建武等的方法测定所筛菌株的产脂肪酶活（李建武等，1994）

1.7产酶条件的优化

改良产酶发酵培养基瓶装量为50 mL/250 mL时，根据接种量、碳源、pH、温度、盐度等影响产脂肪酶的因素，依次进行LD-1302产脂肪酶活条件的优化。

1.7.1接种量对产酶的影响

研究菌起始浓度为5×105CFU/mL的LD-1302的接种量分别为0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%时，对LD-1302产脂肪酶的影响，每隔24 h测定酶活一次，连续测定3次，筛选最适温度接种量。

1.7.2碳源对产酶的影响

研究以1%的橄榄油、椰子油、葵花籽油为碳源时，对LD-1302产脂肪酶活性的影响，每隔24 h测定酶活一次，连续测定3次，筛选最适碳源。

1.7.3pH对产酶的影响

研究改良产酶发酵培养基起始pH分别为5、6、7、8、9时，对LD-1302产脂肪酶的影响，每隔24 h测定酶活一次，连续测定3次，筛选最适pH。

1.7.4温度对产酶的影响

研究改良产酶发酵培养基摇瓶发酵温度分别为27℃、37℃、47℃时，对LD-1302产脂肪酶的影响，每隔24 h测定酶活一次，连续测定3次，筛选最适温度。

1.7.5盐度对产酶的影响

研究海水盐度分别为28、30、32、34、36时，对LD-1302产脂肪酶的影响，每隔24 h测定酶活一次，连续测定3次，筛选最适盐度。