菌悬液稀释倍数与OD600非倍数关系的实验验证
摘 要：将实验室从陕北石油污染土壤中分离出来的S3菌用牛肉膏液体培养基在摇床中以30℃、160 r/min恒温培养48 h，离心、用磷酸盐缓冲液淋洗3次后，用磷酸盐缓冲溶液配制成菌悬液。然后，用磷酸盐缓冲溶液将菌悬液稀释成不同倍数，以磷酸盐缓冲溶液作为空白对照，用丹麦Biosense公司oCelloScope微生物生长动态监测系统在600 nm下测量菌悬液的吸光度。得出结论，溶液稀释倍数和OD600是乘幂关系，关系式为Y=1.4025'，R²=0.9988。
由于微生物的个体较小，测量微生物生长不是测其细胞个体大小，而是群体的增加量，所以，对于微生物生长繁殖量的测定需要一些特定的方法手段。测定微生物生长的方法很多，可分为直接法和间接法两大类。直接法是对菌体细胞的体积、质量等进行直接测定，有测体积法和称干重法。间接法有比浊法和生理指标法。
本实验室常用比浊法测量微生物生长，它是估算细胞总菌数的一种较快且非常有用的方法。其原理是菌体不透光，光束通过菌悬液时会被散射或吸收，使得透光量降低。在一定浓度范围内，菌悬液中细胞浓度与浊度成正比，与透光度成反比，即与光密度(optical density, OD)成正比。因此，可以借助丹麦Biosense公司oCelloScope微生物生长动态监测系统，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。在一定的菌体浓度范围内，比浊法是相当准确的，而且测量快速、操作方便；另外还具有不会损伤或在较大程度上影响样品的优点。但是，此方法容易受到样品颜色与杂质的干扰，菌悬液浓度测定有一定的范围，浓度太高，会造成细胞数目与浊度之间失去线性关系，同时，也会超过仪器的测量范围。
OD值较大超过仪器测量范围在实验中经常会遇到，这时需要将菌悬液稀释后测量，然后再将测量值扩大相应的稀释倍数后作为该菌液的实际OD值。我们通常认为二者是简单的倍数关系。然而通过本实验发现，溶液稀释后的OD值和稀释倍数之间不是简单的倍数关系，而是乘幂关系，更正了我们先前认为的二者是简单的倍数关系这一认识。
1 实验材料
1.1 菌种来源
在实验室从陕北石油污染土壤中分离出来的菌种：S3。
1.2 实验药品
K₂HPO₄·3H₂O（天津市化学试剂厂，分析纯）；(NH₄)₂SO₄（西安化学试剂厂，分析纯）；CaCl₂（汕头市西陇化工厂，分析纯）；NaOH（西安化学试剂厂，分析纯）；蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司，生化试剂）；MgSO₄·7H₂O（西安化学试剂厂，分析纯）；琼脂粉（北京奥博星生物技术有限责任公司，生化试剂）；牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司，生化试剂）；KH₂PO₄（天津市登封化学试剂厂，分析纯）；NaCl（天津市凯通化学试剂厂，分析纯）。
1.3 实验仪器
BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；HG303电热恒温培养箱（南京实验仪器厂）；电子万用炉（天津市泰斯特仪器有限公司）；SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；国华THZ-82恒温振荡器（生物摇床，常州国华电器有限公司）；丹麦Biosense公司oCelloScope微生物生长动态监测系统；紫外无菌操作台（自制）。
1.4 实验中的培养基及主要试剂
(1) 牛肉膏蛋白胨固体培养基：NaCl 5.0 g，牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，蒸馏水 1 L，加热至透明色后将溶液pH调到7.2~7.4，煮沸时加琼脂15~20 g。121 ℃高压灭菌30 min，制成平板或斜面，待用。
(2) 牛肉膏蛋白胨液体培养基：NaCl 5.0 g，牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，蒸馏水 1 L，加热至透明色后将溶液pH调到7.2~7.4，121 ℃高压灭菌30 min，待用。
(3) 磷酸盐缓冲溶液：K₂HPO₄·3H₂O 25.82 g，Na₂HPO₄·12H₂O 33.40 g，KH₂PO₄ 8.70 g，NH₄Cl 5.0 g，1 L蒸馏水。
2 实验方法
2.1 菌悬液制备
在无菌操作台中，从保存有S3菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基中接种两环菌体，将该菌体放到盛有150 mL牛肉膏液体培养基的锥形瓶中，8层纱布封口，160 r/min、30 ℃在摇床中恒温培养48 h。然后，将培养液用离心机在10000 r/min、4 ℃下离心10 min，倒去上清液，再用磷酸盐缓冲溶液淋洗，用离心机在10000 r/min、4 ℃下离心10 min，倒去上清液，同样的方法，用磷酸盐缓冲溶液淋洗3次。然后，用磷酸盐缓冲溶液悬浮离心后的菌，待用。
2.2 不同稀释倍数菌悬液OD₆₀₀的测定
将制备的菌悬液，加磷酸盐缓冲溶液稀释不同倍数，以磷酸盐缓冲溶液作空白，用oCelloScope微生物生长监测系统在波长600 nm下测量不同稀释倍数的菌悬液OD₆₀₀。
实验中，为了提高实验数据的精确度，做了3个平行样。
S3菌悬液不同稀释倍数的OD₆₀₀值见表1，S3菌悬液不同稀释倍数和OD₆₀₀的关系见图1。
3 结果与讨论
表1 S3菌悬液不同稀释倍数的OD₆₀₀
| 倍数 | ①OD₆₀₀ | ②OD₆₀₀ | ③OD₆₀₀ | 平均值 ± 标准偏差 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 1.357 | 1.371 | 1.377 | 1.368 ± 0.008 |
| 2 | 0.733 | 0.738 | 0.742 | 0.738 ± 0.004 |
| 3 | 0.518 | 0.522 | 0.525 | 0.522 ± 0.003 |
| 4 | 0.392 | 0.394 | 0.393 | 0.393 ± 0.001 |
| 5 | 0.299 | 0.303 | 0.306 | 0.303 ± 0.003 |
| 6 | 0.258 | 0.259 | 0.264 | 0.260 ± 0.003 |
| 8 | 0.200 | 0.201 | 0.208 | 0.203 ± 0.004 |
| 10 | 0.157 | 0.160 | 0.162 | 0.160 ± 0.002 |
由表1可知，最大标准偏差是±0.008，最小标准偏差是±0.001，测量结果可靠，有可信度。由图1可知，S3菌悬液稀释倍数和OD₆₀₀是乘幂关系，关系式为Y=1.4025ˣ，R²=0.9988。这一结果更正了我们通常认为的菌悬液稀释倍数和OD₆₀₀是简单的倍数关系的认识，同时，可以通过测定已知稀释倍数的菌悬液OD₆₀₀，再根据表1提供的数据和图1中的关系式推求出菌悬液的初始菌量大小。这一实验结果，对后续实验的顺利进行、正确获得实验数据有参考意义。
图1 S3菌悬液稀释倍数与OD₆₀₀的关系
(注：图中OD₆₀₀是3个平行样的平均值)
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