基于oCelloScope的出芽短梗霉菌多形态细胞时序演变定量研究
研究背景：本研究以广泛用于作物与生防木材涂层的功能性黑酵母——出芽短梗霉菌为对象，针对其营养期可形成芽孢子、膨大细胞（swollen cells）和菌丝（hyphae）等多形态细胞类型、但各类细胞在生防与促生性能中的作用长期不明的瓶颈，在静态液体培养体系中对其细胞动态行为进行了定量解析并建立动力学模型。研究选取 CBS 584.75（新模式菌株）、CBS 100280（高盐水分离）、CBS 109810（切尔诺贝利墙体分离）和 CBS 140240（亚麻籽油浸渍松木分离）4 个生态来源差异较大的菌株，以 pH 5 马铃薯葡萄糖 broth 为培养基、26 ℃ 静置培养，采用 oCelloScope 微生物动态监测系统结合形态学参数（面积、圆度、细线长度、对比度）自动识别三类细胞，并对 CBS 584.75 进行单细胞谱系追踪；在此基础上构建含 Erlang 链的三室常微分方程组，以孵化时间为输入，拟合芽孢子→膨大细胞→菌丝的分化速率、各类细胞产新芽孢子的分裂速率及发育滞留时间，并预测 16 h 以后至 72 h 的细胞组成。结果显示接种时芽孢子占比 >75%，但 6–10 h 即因向膨大细胞大量分化而让出优势地位（CBS 584.75 于 10 h 时芽孢子仅约 10%、膨大细胞达 73%），13 h 后膨大细胞转而向菌丝分化、菌丝比例上升，16 h 时 CBS 584.75 菌丝可达 46%。单细胞分析进一步揭示 10 h 前新芽孢子主要由膨大细胞分裂产生，13–16 h 后菌丝取代膨大细胞成为产芽孢子主力。模型预测 18 h 起芽孢子重新成为最优势类群，72 h 时芽孢子/膨大细胞/菌丝相对丰度约为 57%/32%/11%，与独立 72 h 培养实测值（49%/39%/12%）吻合良好。该研究首次在定量层面勾勒出 A. pullulans静置液培中"芽孢子↔膨大细胞↔菌丝"的时空转换规律，并为后续针对不同应用目标（如木涂层偏好菌丝/厚垣孢子以产黑色素抗 UV、生防制剂优化芽孢子比例）调控培养条件、提升产品性能提供了可预测的动力学框架。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
将 A. pullulans 四个菌株接种于 24 孔悬浮培养板（Greiner Cellstar 662160），每孔 400 μl PDB（pH 5）、接种约 10³ 细胞，26 ℃ 静置培养；接种后 1 h 让细胞沉底即启动扫描，每小时采图一次、最长跟踪 22 h，扫描区长度设为 855 μm，单对象面积阈值 70–6000 像素，单帧最大追 1000 个对象。四类细胞（芽孢子、膨大细胞、厚垣孢子、菌丝；其中假菌丝归入菌丝）依据 oCelloScope 输出的面积、圆度、细线长度、对比度四参数自动判别。oCelloScope 微生物动态监测系统替代了传统人工定时取样镜检，实现 1–22 h 非扰动连续观测。借助形态学阈值把混培养中的三种主要细胞类群自动拆分，直接输出 "全培养相对丰度时序"（如 CBS 584.75 从 1 h 芽孢子 78% → 10 h 10% → 16 h 回升 22% 的动态曲线）。给出单细胞谱系（芽孢子→膨大细胞→菌丝的分化比例、不同时间段谁在产芽孢子）和最终的 ODE 模型（1–16 h 三类细胞丰度序列作拟合输入）提供了可复现的定量底料。
实验结论
4株生态来源差异显著的出芽短梗霉菌在pH5静态PDB液培中共享"芽孢子→膨大细胞→菌丝"的分化与分裂规律，接种时芽孢子占比超75%，6–10 h因芽孢子大量分化为膨大细胞让出优势地位（新模式菌株CBS 584.75在10 h时芽孢子仅约10%、膨大细胞达73%），13 h后膨大细胞转向分化为菌丝，16 h时CBS 584.75菌丝占比升至46%、芽孢子占比小幅回升至22%；单细胞谱系追踪进一步显示，10 h前新生成的芽孢子主要由膨大细胞分裂产生，13–16 h阶段菌丝取代膨大细胞成为芽孢子输出的主要来源，16 h后芽孢子占比持续回升。基于1–16 h观测数据构建的含Erlang链三室ODE模型，拟合后得到10 h后菌丝的芽孢子产率已超过芽孢子、膨大细胞自身，且预测18 h起芽孢子重新成为培养物中最优势类群，72 h时芽孢子/膨大细胞/菌丝相对丰度约为57%/32%/11%，与独立72 h静态培养实测值（49%/39%/12%）吻合良好。本研究首次在定量层面明确了A. pullulans静态液培下的细胞时空转换规律，也为后续针对不同应用场景（如木涂层需提升菌丝/厚垣孢子占比以增强抗UV能力、生防制剂可优化芽孢子比例）调控培养条件、提升产品性能提供了可复现的动力学依据。
图1、基于16小时静态液体PDB培养实验数据（B）拟合数学模型所得的A. pullulans CBS 584.75（长时）种群动态及细胞分化情况的模型结构概览（A）。为此，采用了生物重复三次、每组包含三个技术重复的数据。图B上半部分显示了三种细胞类型在时间上的相对丰度，下半部分则以对数变换后的y轴表示绝对数量。红色虚线标示出菌丝体产生的子囊孢子数量超过其他细胞类型的时刻。
图2、使用 oCelloScope 动态监测系统自动进行的参数进行细胞类型识别
图3、静态液态PDB培养中，A. pullulans菌株CBS 584.75（A）、CBS 100280（B）、CBS 109810（C）和CBS 140240（D）的延时显微镜图像，显示了分生孢子（实心箭头）、肿胀细胞（空心箭头）、衣原体孢子（空箭头）以及菌丝（实心箭头）。比例尺为100 μm。
图4、在静态液体PDB中孵育16小时期间，A. pullulans菌株CBS 584.75（A）、CBS 100280（B）、CBS 109810（C）和CBS 140240（D）的细胞动力学。T = 0为开始孵育后1小时的时间点，此时细胞已沉降至孔底。误差棒表示三次生物重复和三次技术重复的标准差（SD）。
图5、最高质量的拟合结果（kB > 2，kS = kH > 5）表明，在约10小时后，菌丝体在产生子囊孢子方面比其他细胞类型更具生产力
总结
出芽短梗霉菌用作作物和木材的生物保护剂，可促进植物生长。该真菌形成多种细胞类型，包括分生孢子、肿胀细胞和菌丝。这些细胞在 A. pullulans 生物保护性能中的作用尚未明确。本研究对四个分离株在液体静置培养中分生孢子、肿胀细胞和菌丝的形成与分化过程进行了定量分析。在16小时的培养过程中，分生孢子由肿胀细胞、菌丝及已有的分生孢子通过细胞分裂形成；同时，分生孢子分化为肿胀细胞，而肿胀细胞则进一步分化为菌丝。结果表明，在培养10小时后，尽管接种时分生孢子占细胞总数的75%以上，但其不再是最主要的细胞类型。基于常微分方程建立了一个数学模型，用于描述固定培养条件下新种型菌株 A. pullulans CBS 584.75 的细胞动态变化。利用其16小时静态液体培养的定量数据作为输入，以培养时间作为变量进行建模。该模型预测，从培养18小时起，气生孢子将再次成为最显著的细胞类型，72小时生长后，气生孢子、肿胀细胞和菌丝的相对丰度分别为57%、32%和11%。细胞分裂与分化的定量评估及其数学模型可用于未来研究中，以优化A. pullulans作为生物保护剂的性能，并促进植物生长。oCelloScope 成像系统是支撑"静态液培时态细胞动态"定量获取的核心设备。 oCelloScope微生物动态监测系统替代传统人工定时取样镜检，实现 1–22 h 非扰动连续观测。借助形态学阈值把混培养中的三种主要细胞类群自动拆分，直接输出 "全培养相对丰度时序"（如 CBS 584.75 从 1 h 芽孢子 78% → 10 h 10% → 16 h 回升 22% 的动态曲线）。
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