3株奥默柯达酵母生长曲线、pH耐受性、最适生长温度测定及对酱油香气和滋味影响（二）
1.3.5菌种发酵性能研究
1.3.5.1不同盐浓度下生长曲线
调整种子液OD₅₆₀=1，以2%（体积分数）的接种量接种至不同盐浓度的豆芽汁液体培养基，每4 h取一次样测定发酵液OD₅₆₀值，以培养时间为横坐标，OD₅₆₀值为纵坐标绘制生长曲线。
1.3.5.2最适生长温度
调整种子液OD₅₆₀=1，以2%（体积分数）的接种量接种至对应盐浓度的YPD液体培养基，分别于24、28、30、32、34、37、40℃下培养24 h，以培养基为空白对照，测定发酵液OD值。
1.3.5.3最适生长pH值
调整种子液OD₅₆₀=1，以2%（体积分数）的接种量接种至对应盐浓度的pH值为1~10的YPD液体培养基，于28℃培养24 h，取3 mL发酵液于5 mL离心管，10 000 r/min离心5 min，去除上清液，加入3 mL生理盐水重悬离心洗涤3次，以生理盐水为空白对照，测定OD₅₆₀值。
1.3.5.4三株K.ohmeri豆芽汁发酵液挥发性风味物质测定
将3株酵母菌分别挑取一环接种于160 g/L豆芽汁液体培养基中，在28℃静置培养7 d后，取菌体培养液置于2 mL的气质进样瓶中测定挥发性风味物质含量。
1.3.6添加高盐稀态酱醪醪发酵应用
筛选发酵性能最强的K.ohmeri菌株进行添加酱醪醪发酵的应用。高盐稀态酱醪醪发酵采用300 g成品曲与230 g/L的盐水按料液比1:2（g:mL）混合，30℃发酵90 d，每日对酱醪醪进行搅拌通气。调整KD13种子液菌悬浓度为10⁷CFU/mL，于发酵第30天添加至酱醪醪，添加量为5%（体积分数）。以未额外添加风味菌的酱醪醪样为对照组，取不同发酵时间的酱醪醪经滤布过滤后获得酱油。
1.3.7分析方法
1.3.7.1酱油理化指标测定
乙醇含量的测定参考GB 5009.225-2016《酒中乙醇浓度的测定》中的密度瓶法。还原糖测定参照GB 5009.7-2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》，总酸、氨态氮测定参照国标GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》。
1.3.7.2挥发性风味物质测定
参考JIANG等固相微萃取-气相色谱-质谱联用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS）的方法对酱油的挥发性风味物质进行定性和定量分析。
1.3.7.3酱油感官评定
参考JIANG酱油感官评价的方法。
1.4数据处理及绘图
利用MegaX绘制系统发育树；利用Excel进行平均值和标准差计算；利用Origin 2023进行数据可视化；利用SPSS Statistics 26进行差异显著性分析；利用Omicstudio绘制热图；利用SIMCA 14.1进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）。所有的试验采用3个平行。
2结果与分析
2.1耐盐产乙醇K.ohmeri的筛选、鉴定及安全性
2.1.1酱醪醪中耐盐生香酵母的筛选、分子生物学鉴定
由于柯达酵母属在酱油发酵的3~4月占比最高，因此选择发酵3~4月的高盐稀态酱醪醪采样，一共分离得到21株纯培养酵母菌株，其形态特征及豆芽汁发酵液嗅闻结果如表1所示。21株酵母的豆芽汁发酵液具有花果香、酒香、醇香等香气特征。对所分离的生香酵母进行26S rDNA D1/D2区测序并构建系统发育树。如图1所示，共获得4个种，分属4个属，柯达酵母数量最多（10株），且均为K.ohmeri，其余为鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）（6株）、埃切假丝酵母（Starmerella etchellsii）（4株）、多变拟威克酵母（Wickerhamiella versatilis）（1株）。
表1菌株编号形态香气嗅闻结果
K02、KD01、KD02、KD03、KD04、KD05、KD10、KD13、KD28、KD30单菌落呈白色，较厚，表面干燥有褶皱，边缘不平整，为花瓣状；细胞呈椭圆形，有假菌丝香气呈浓郁的花果香及酒香
K11、K14、K15、K16、K17、K19单菌落呈乳白色，较厚，表面较干燥，边缘光滑呈圆形；细胞呈圆形或椭圆形香气呈较浓郁的花果香
K08单菌落呈乳白色，表面湿润，边缘光滑呈圆形；细胞呈椭圆形香气较淡，有花果香
K01、K02、K04、K06单菌落呈乳白色，表面湿润，边缘光滑呈圆形；细胞呈椭圆形香气淡，有花果香
2.1.2 K.ohmeri产乙醇能力比较
酱油中的醇类物质以乙醇为主，主要由耐盐酵母代谢产生。乙醇能赋予酱油愉悦的醇香，是形成乙酯的重要底物，且对酱油有一定的防腐作用。由于酱油发酵周期长，因此采用盐质量浓度为100 g/L的豆芽汁培养基替代酱醪醪发酵快速判断菌株的产乙醇能力。
由图2可知，10株不同的K.ohmeri乙醇产量均大于1%（体积分数），KD13、KD28和K02产量较高，分别为1.30%、1.19%和1.19%。
2.1.3 K.ohmeri的溶血性
发酵食品中的微生物若产生溶血毒素会对人体造成一定危害，因此必须对食品发酵菌株进行溶血安全性测试。刘爽等对酱油发酵用菌Z.rouxii的安全性（溶血性）进行了研究。以S.aureus为阳性对照，S.cerevisiae为阴性对照，对10株K.ohmeri进行溶血性测试，结果如图3所示。10株菌均未产生草绿色色环（α溶血）或透明溶血环（β溶血），表明10株酵母均无溶血性，无溶血风险，可以进一步开展研究。