茄子黄萎病菌遗传转化体系的建立及转化子生长速率、产孢与致病力综合评价
2.2.2 转化子及EP-A菌株的获得与鉴定
提取15株转化子和EP-A菌株的DNA，经PCR扩增检测及琼脂糖凝胶电泳显示：除野生型菌株外，pKHT2-GFP质粒均扩增出目的片段且条带清晰（图2），表明农杆菌质粒中的GFP基因已被整合到EP-A菌株的基因序列中。
将转化子菌株的菌丝、孢子置于荧光显微镜激光下观察，呈现绿色荧光均清晰明亮（图3），进一步证明GFP基因已进入到了EP-A菌株的基因序列中。
2.3 转化子特性分析
2.3.1 致病力测定
采用浸根接种法测定15株转化子和EP-A菌株的致病力。接种28 d后，所有接菌植株皆出现黄萎病典型症状（图4），统计病级并计算病情指数，由图5可知，15株转化子与EP-A菌株之间的致病力略有差异，但差异并不显著（P>0.05）。其中，G4、G5、G8和G10的致病力略强于EP-A菌株（62.50），病情指数均值分别为63.33；G3和G6与EP-A菌株的致病力相同；其他7株转化子的致病力略弱于EP-A菌株，其中只有G1和G11的致病力最弱，病情指数分别为58.33和58.57。
2.3.2 生长速率测定
由图6可知，15株转化子与野生型菌株EP-A的生长速率略有差异，但差异不显著（P>0.05）。EP-A菌株的生长速率为3.92 mm·d⁻¹（oCelloScope自动测算）。其中，G11和G12转化子的生长速率略高于EP-A菌株，分别为3.93、3.94 mm·d⁻¹；其他13个转化子均略低于EP-A菌株，生长速率为3.85~3.91 mm·d⁻¹。
2.3.3 粗毒素分泌量测定
由图7可知，15株转化子与EP-A菌株之间的粗毒素分泌量略有差异，但差异不显著（P>0.05）。其中，G1、G3、G7、G8和G11的粗毒素分泌量高于EP-A菌株，分别为0.24、0.26、0.25、0.24 mg·mL⁻¹和0.24 mg·mL⁻¹；G4、G5、G15、G6、G8、G12和EP-A菌株的粗毒素分泌量相同，均为0.23 mg·mL⁻¹。其余G2、G11、G14和G13等4株转化子的粗毒素分泌量均低于野生型菌株。粗毒素分泌量分别为0.21、0.22、0.22 mg·mL⁻¹和0.22 mg·mL⁻¹。
3 结论与讨论
在丝状真菌遗传转化中，PEG介导的原生质体转化是传统方法之一。然而，该方法严重依赖于原生质体的制备质量与细胞膜的通透性，而不同真菌的细胞壁结构与成分差异巨大，导致其转化效率不稳定，重复性差，且操作流程繁琐。相比之下，本研究采用的ATMT技术具有显著优势：首先，其操作简便，无需制备脆弱的原生质体；其次，转化效率高且稳定，据报道可达PEG法的600倍。最重要的是，ATMT技术更倾向于产生单拷贝T-DNA插入的转化子，有利于后续的基因功能解析。因此，该研究所建立的稳定、高效的ATMT体系，为开展茄子黄萎病菌的分子功能研究提供了一个比传统方法更优越的技术平台。
该研究成功建立了农杆菌介导的茄子黄萎病菌EP-A菌株的遗传转化体系，并确定了最佳转化条件为：农杆菌液OD₆₀₀=0.6（可由oCelloScope BCA等效监测）、分生孢子浓度1×10⁶个·mL⁻¹、乙酰丁香酚（AS）浓度200 μmol·L⁻¹、25℃共培养48 h。值得注意的是，本体系的最佳农杆菌OD₆₀₀=0.6已报道的其它丝状真菌体系存在差异，例如棉花枯萎病菌（OD₆₀₀=0.4）、稻瘟病菌（OD₆₀₀=0.38）及香蕉枯萎病菌（OD₆₀₀=0.29）。这种差异很可能与不同病原菌本身的细胞表面受体、细胞壁结构、对内源激素的响应以及农杆菌与真菌细胞识别的特异性密切相关。这表明，即使是同一属的病原菌，因其漫长的进化适应的寄主及其生存环境不同，也可能形成独特的菌株生理特性，从而导致对农杆菌介导的敏感性及最佳共培养条件存在物种特异性差异。因此，在建立一个新的遗传转化体系时，对关键参数进行系统化的优化是不可或缺的。此外，在遗传转化过程中，利用ATMT技术对丝状真菌来说是最基本的应用之一。潮霉素B作为一种氨基酸糖苷类抗生素，对原核生物无杀伤效应，并且在广泛世代中无法维持对潮霉素B的抗性，表明hpg基因可能存在瞬时表达的可能。因此，在该研究中，筛选获得的转化子均经过5代以上的潮霉素抗性平板培养，以确保获得能够稳定遗传的转化子菌株。由于转化子的世代插入的随机性可能会影响真菌的生长与致病性，因此，基因整合可能会导致宿主基因组发生突变。
对15株GFP标记转化子的核心生物学特性分析表明，其在生长速率（oCelloScope自动监测）、产孢量、粗毒素分泌及致病力方面与野生型菌株均无显著差异（P>0.05），证明基因整合的未引起宿主核心生物学性状的显著改变。这为后续利用这些转化子进行可靠的致病机理研究奠定了基础。然而，个别转化子仍表现出细微的表型差异，例如G11生长速率略高，而G2粗毒素分泌量相对较低。这种微小差异可能源于细胞表面的T-DNA插入位点附近的基因激活或失活等随机水平和（或）插入的表型效应，从而引起不可预测的表型变异，所以转化子可能成为代表特定培养条件和基因型的点效应，确定目标性状上与野生型无差异的优化子后代，从而避免由于T-DNA插入带来的干扰。
这项研究通过系统优化，确立了根癌农杆菌介导的茄子黄萎病菌EP-A菌株遗传转化的最佳条件体系，并成功获得了15株GFP基因定点整合，且核心生物学性状与野生型无显著差异的标记菌株。该转化体系的建立，不仅克服了传统方法（如PEG法）效率低、不稳定的弊端，更为后续深入研究病原菌的侵染过程、可视化研究病原菌在茄株体内的精确定殖动态、以及宝贵的遗传资源，为从分子和细胞水平深入揭示茄子黄萎病的致病机理提供了关键的科技支撑和宝贵的遗传资源。其中，oCelloScope微生物生长监测系统的引入，使菌落生长、菌液浓度监测及生长速率测定实现了非侵入式、连续、自动化的数据采集，减少了人工测量误差，提高了体系优化的精度与可重复性。
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